Quantifizierung der Nahrungsaufnahme bei Caenorhabditis elegans durch Messung der bakteriellen Clearance
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Assay zur Quantifizierung der Fütterungsrate von Caenorhabditis elegans , der auf der Messung der Clearance von Bakterien in Flüssigkulturen basiert.
Abstract
Die Nahrungsaufnahme ist ein wesentlicher biologischer Prozess für das Wachstum, die Fortpflanzung und das Überleben eines Organismus. Dieser Assay zielt darauf ab, die Nahrungsaufnahme von Caenorhabditis elegans (C. elegans) zu messen, ein wichtiger Parameter bei der Untersuchung der Genetik des Alterns oder des Stoffwechsels. Bei den meisten Arten wird die Fütterung durch Messung der Differenz zwischen der bereitgestellten Futtermenge und der nach einem bestimmten Zeitintervall verbleibenden Menge bestimmt. Die hier vorgestellte Methode verwendet die gleiche Strategie, um die Fütterung von C. elegans zu bestimmen. Er misst die Menge an Bakterien, der Nahrungsquelle von C. elegans, die innerhalb von 72 h beseitigt wurden. Diese Methode verwendet 96-Well-Mikrotiterplatten und ermöglichte das Screening von Hunderten von Medikamenten auf ihre Fähigkeit, die Nahrungsaufnahme in einer Geschwindigkeit und Tiefe zu modulieren, die in anderen Tiermodellen nicht möglich ist. Die Stärke dieses Assays besteht darin, dass er es ermöglicht, die Fütterung und die Lebensdauer gleichzeitig zu messen und das Verschwinden von Lebensmitteln direkt zu messen, und somit auf den gleichen Prinzipien basiert, die auch für andere Organismen verwendet werden, was den Vergleich von Art zu Art erleichtert.
Introduction
Caenorhabditis elegans wurde in der Alternsforschung ausgiebig eingesetzt. Es war ein leistungsfähiges Modell, um die Genetik zu untersuchen, die der stoffwechselvermittelten Langlebigkeit zugrunde liegt, die durch Ernährungseinschränkungen, verminderte mitochondriale Aktivität oder verminderte Insulinsignalisierung induziert wird. 1,2,3,4,5,6,7. Die Messung der Fütterung im Kontext der Langlebigkeit hat sich für C. elegans jedoch aufgrund der geringen Größe des Tieres als schwierig erwiesen 3,8,9,10,11,12,13,14,15.
Die Fütterung ist ein grundlegendes biologisches Verhalten, das für das Überleben erforderlich ist, und seine strenge Regulierung ist der Kern der Aufrechterhaltung der Stoffwechselgesundheit, der Fortpflanzung und des Alterns. Das Fressverhalten wird durch mehrere Signalwege sowohl im Nervensystem als auch in der Peripherie gesteuert und kann daher nur in vivo untersucht werden 16,17,18,19. Die Ernährung stellt die erste von drei Säulen dar: (i) die Energieaufnahme, (ii) die Energiespeicherung und (iii) der Energieverbrauch, der die Energiehomöostase eines Organismus steuert. Die Fütterung bei C. elegans wurde hauptsächlich durch Messung des Pharynxpumpens untersucht, der durch die Kontraktionsrate des Pharynx definiert wird. Dieser Ansatz hat entscheidende Einblicke in das Fressverhalten von C. elegans geliefert 3,4,8,12,13,20,21; Das Pumpen des Rachens, insbesondere gemessen über kurze Zeiträume von Minuten, korreliert jedoch nicht unbedingt mit der Nahrungsaufnahme.
Die Nahrungsaufnahme wird nicht nur durch die pharyngeale Pumprate bestimmt, sondern auch durch Parameter wie Dauer und Häufigkeit der Fressvorgänge und die Dichte der Nahrungsbakterien. Ein Tier kann einen sehr hohen Rachenpump haben, aber die Länge seiner Fressanfälle kann kürzer sein, was die erhöhte Frequenz ausgleicht. Ein weiterer Störfaktor ist die Effizienz, mit der beim Pumpen Bakterien aufgenommen und zerkleinert werden können oder auch nicht. Ein extremes Beispiel für die Entkopplung der Nahrungsaufnahme vom Rachenpumpen ist die Zugabe von Serotonin ohne Nahrung (Bakterien). In Gegenwart von exogenem Serotonin pumpen die Tiere mit einer hohen Geschwindigkeit, aber ohne Bakterien führt die hohe Pumprate nicht zur Nahrungsaufnahme 2,6,13,22,23.
Die hier vorgestellte Methode zur bakteriellen Clearance misst die Nahrungsaufnahme von Wurmpopulationen in einzelnen Vertiefungen ebenso wie den Rückgang der Bakterienkonzentrationen im Laufe der Zeit (Abbildung 1). Dieser Ansatz ähnelt denen, die bei anderen Arten verwendet werden, bei denen das Verschwinden von Nahrung ein Maß für die Nahrungsaufnahme darstellt 10,11,24,25,26,27,28. In der ursprünglichen Veröffentlichung haben wir diese Methode zur Messung der Nahrungsaufnahme validiert, indem wir C. elegans mit 15N-Isotopen-markierten Bakterien gefütterthaben 11. Nachfolgende Messungen mittels Massenspektrometrie zeigten, dass die Messung des Verschwindens von Bakterien stark mit dem Auftreten der Isotopenmarkierung korrelierte, was die tatsächliche Aufnahme der Bakterien in das Tier aufzeigte11. Daher sind wir zuversichtlich, dass der bakterielle Clearance-Assay in den meisten Fällen die Nahrungsaufnahme darstellt. Der Zweck des Assays besteht nicht darin, den pharyngealen Pump-Assay zu ersetzen, sondern den Werkzeugkasten der Assays zu erweitern, um die Fütterung und den Stoffwechsel bei C. elegans und deren Zusammenhang mit dem Altern und der Langlebigkeit zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll misst die bakterielle Clearance als Messwert für die Nahrungsaufnahme von C. elegans in 96-Well-Mikrotiterplatten. Die Dosis-Wirkungs-Kurven im Abschnitt “Repräsentative Ergebnisse” zeigen, dass der Assay die Nahrungsaufnahme quantitativ misst, eine Vorstellung, die unabhängig von isotopenmarkierten Bakterien bestätigt wurde11. Mit diesem Assay haben wir erfolgreich von der FDA zugelassene Medikamente wie Antipsychotika mit bekannten metabolischen Nebenwirkungen beim Menschen getestet und gezeigt, dass diese Medikamente die Fütterung von C. elegans erhöhen 10,26. Der Assay ist nützlich, um die Genetik oder Pharmakologie der Fütterung zu untersuchen und stellt ein neues Werkzeug für die C. elegans-Forschung zur Untersuchung des Stoffwechsels dar. Dieser Assay bietet eine kostengünstige Methode, um die Fütterung auf skalierbare und zeitsparende Weise zu untersuchen, was bei den meisten anderen Organismen nicht möglich ist. Unsere Arbeit an von der FDA zugelassenen Medikamenten zeigt, dass viele Nebenwirkungen, die bei menschlichen Patienten beobachtet werden, auch bei C. elegans beobachtet werden, was die evolutionäre Konservierung aufzeigt 24,26,32.
Der Assay ist durch die Bakterienkonzentration begrenzt, die innerhalb des linearen Bereichs der OD600-Messung gemessen werden kann. Infolgedessen sind die Anzahl der Würmer und der Bereich der Bakterienkonzentrationen, die untersucht werden können, begrenzt. Zu viele Würmer beeinflussen OD600 , indem sie die Bakterien zu schnell verzehren und somit die Bakterienkonzentration aus dem linearen OD600 “fressen”. Unserer Erfahrung nach ist die Variabilität in der bakteriellen Vorbereitung der entscheidende Parameter, der dazu führt, dass die Ergebnisse von Experiment zu Experiment variieren. Wir haben erfolglos versucht, große Mengen von Bakterien einzufrieren oder lyophilisierte Bakterien zu verwenden. In diesen Fällen wurde entweder die Selbstlyserate zu hoch, oder die Bakterien waren von einer Qualität, die die Entwicklung von C. elegans verlangsamte. Unsere Tests waren jedoch nicht erschöpfend, und dieses Problem könnte lösbar sein.
Im Allgemeinen ist die Selbstlyserate der Bakterien am schwierigsten zu kontrollieren und kann zu erheblichen Schwankungen führen. Wir fanden heraus, dass einige Medikamente die Selbstlyserate auf ein Niveau erhöhen können, bei dem der Assay die Nahrungsaufnahme nicht zuverlässig bestimmen konnte. Da die Selbstlyserate im Laufe der Zeit im Assay zunimmt, haben wir die Nahrungsaufnahme über den 5. Tag des Erwachsenenalters hinaus nicht gemessen. In diesem Alter sind die Bakterien ~10 Tage in Kultur. Um die Nahrungsaufnahme nach dem 5. Tag des Erwachsenenalters zu messen, müssen die alten Bakterien abgewaschen und durch frische ersetzt werden.
Der vorgestellte Assay ist eine Erweiterung unseres auf 96-Well-Mikrotiterplatten basierenden Lebensdauer-Assays31. Diese Kombination ermöglicht die Messung der Lebensdauer und der Nahrungsaufnahme in derselben Population. Während der hier vorgestellte Bakterien-Clearance-Assay aufgrund der bakteriellen Selbstlyse keine Bestimmung der Nahrungsaufnahme über das gesamte Leben von C. elegans ermöglicht, liefert er solide Daten für die ersten vier Tage des Erwachsenenalters, die Zeit mit der höchsten Nahrungsaufnahme. Insbesondere für die Entdeckung kleiner molekularer Wirkstoffe ist die Kontrolle der Nahrungsaufnahme unerlässlich. Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass der vorgestellte Assay für die C. elegans-Gemeinschaft nützlich sein wird und das Instrumentarium zur Untersuchung des Stoffwechsels oder zur Steuerung des Stoffwechsels im Rahmen von Alterungs- und Lebensdauerstudien erweitert.
Planung:
Bevor Sie planen, die Nahrungsaufnahme zu messen, müssen einige Überlegungen angestellt werden.
Abtötung der Bakterien:
Wir töten Bakterien durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen in einer konischen 50-ml-Röhre (900 Gray für 4 h eingestellt auf 160,0 kV und 25,0 mA). Für die Bestrahlung verwenden wir den RS2000 von Rad Source. Je nach Ausstattung können die spezifische Zeit und die Strahlendosis von Einrichtung zu Einrichtung variieren. Die vollständige Abtötung der Bakterien muss durch Plattieren der Bakterien nach der Bestrahlung bestimmt werden, um Überlebende durch Wachstum zu erkennen. Es ist wichtig, alle Bakterien abzutöten, um ein Wachstum während des Assays zu verhindern, da dies zu einer Unterschätzung der Fütterung oder sogar zu negativen Fütterungswerten führt. Wichtig ist, dass die Bakterien abgetötet werden, damit C. elegans sie immer noch frisst. Nach unserer Erfahrung gibt es drei Möglichkeiten, große Mengen an Bakterien zuverlässig abzutöten: (i) Bestrahlung durch Röntgenstrahlen, (ii) durch γ-Strahlen und (iii) die Zugabe von Formaldehyd29,30. Die Selbstlyseraten zwischen diesen drei Methoden sind vergleichbar, mit einem Variationskoeffizienten von 8 % zwischen den Selbstlyseraten für die in Abbildung 3B gezeigten Experimente. Methoden, die in unseren Händen nicht zuverlässig funktionierten, waren UV-Bestrahlung, Antibiotika-Cocktails, Hitzeinaktivierung und Natriumazid. Diese Methoden töten die Bakterien entweder nicht vollständig ab (UV-Strahlung und Antibiotika), produzieren Bakterien, die C. elegans nicht frisst (Hitze), oder verändern die Nahrungsaufnahme (Natriumazid).
Anzahl der Replikate:
Nach unserer Erfahrung sind die Faltenveränderungen in der Fütterung im Vergleich zu den beobachteten Schwankungen in der Regel gering. Daher erfordert die Messung von Veränderungen in der Nahrungsaufnahme mehrere Replikationsvertiefungen. Abbildung 2A,B zeigt 96-Well-Platten, die für vier oder sechs verschiedene Bedingungen ausgelegt sind, mit 21 oder 14 Replikat-Wells und zwei Selbstlyse-Kontrollwells ohne Würmer. Angesichts der großen Variabilität und der relativ geringen zu erwartenden Veränderungen sind 0,5-2,5-fache Veränderungen in der Fütterung tendenziell die untere und obere Grenze. Wir empfehlen 14 bis 21 Replikationsvertiefungen für jede Bedingung und mindestens zwei Selbstlysekontrollvertiefungen, die im Folgenden beschrieben werden. Diese Replikate reichen aus, um quantitative Dosis-Wirkungs-Kurven für Arzneimittel zu erstellen, die die Fütterung verändern11,26.
Selbstlyse-Kontrollen:
Der OD600 misst die Anzahl der Partikel in einer Lösung, meist unabhängig von der Partikelgröße. Abgestorbene Bakterien werden jedoch lysiert und verlieren ihre Partikelnatur. Wir nennen dies Selbstlyse, die unabhängig von Würmern abläuft und die OD600-Messungen senkt, ohne dass die Würmer fressen. Die Selbstlyse findet während des Assays statt und muss unabhängig voneinander in mindestens zwei Vertiefungen pro Bedingung gemessen werden. Diese Vertiefungen erhalten die gleiche Behandlung wie die anderen unter dem gleichen Zustand, nur dass sie keine Würmer enthalten. Wir fanden heraus, dass viele Medikamente auch die Selbstlyserate verändern können. Daher benötigt jeder Zustand unabhängige Selbstlysekontrollwells mit ihrer jeweiligen Konzentration. Abbildung 2 zeigt einen Plattenaufbau für vier oder sechs Bedingungen, wobei sich alle Selbstlysekontrollwells am unteren Rand der Platte in Reihe H befinden.
N2-Referenzpopulation:
Wir stellten auch fest, dass die absolute Menge der verzehrten Bakterien zwischen den Experimenten schwanken kann, was höchstwahrscheinlich mit der Qualität der Bakterien zusammenhängt. Trotz aller Bemühungen, sie jedes Mal genau gleich zuzubereiten, gibt es Schwankungen. Zum Beispiel können Bakterien geerntet werden, während sie sich während der logarithmischen Wachstumsphase in einem sich teilenden Zustand befinden, und daher viel größer sein als Bakterien, die in der stationären Phase geerntet werden. Daher können diese einfachen Unterschiede in der Bakteriengröße zu Veränderungen in der Anzahl der verzehrten Bakterien und zu unterschiedlichen OD600-Werten führen, da bei den OD600-Messungen nicht zwischen den Größen unterschieden wird. Aus diesem Grund beziehen wir immer eine Population von unbehandelten N2-Kontrolltieren mit ein, die als Referenzwert dienen, entweder auf 1 oder 100% gesetzt, um festzustellen, ob die Versuchsgruppen mehr oder weniger fressen als die N2-Kontrolle. Diese Praxis ermöglicht Vergleiche zwischen Experimenten, auch wenn die OD600-Werte variieren.
Zeitintervalle:
Die Verwendung von OD600-Werten zur Messung der Nahrungsaufnahme erfordert eine messbare Abnahme der Bakterienkonzentration. Da das Kulturvolumen viel größer ist als das der Würmer, müssen sie eine erhebliche Menge an Bakterien fressen, um einen nachweisbaren Unterschied zu machen. Um bei OD600-Werten im linearen Bereich zu bleiben, muss die Bakterienkonzentration zwischen ~1 mg/ml und 10 mg/ml liegen, so dass eine beträchtliche Menge an Bakterien verschwinden muss, um sie zu erkennen. Würmer fressen vom späten L4. bis zum 4. Tag des Erwachsenenalters aufgrund der Eiproduktion am meisten. Somit ist dieses Intervall ideal. Kürzere Intervalle wie 24 h können gemessen werden11, aber das ist erheblich schwieriger und erfordert ~40 Wells pro Zustand. Eine weitere Möglichkeit, die Nahrungsaufnahme der Larven zu messen, besteht darin, die Anzahl der Tiere pro Vertiefung zu verdoppeln. Das Problem bei diesem Ansatz ist jedoch, dass zu viele Würmer beginnen, die OD600-Messwerte zu beeinflussen, wenn sie erwachsen werden.
Stammlösungen für zu testende Medikamente:
Wenn Medikamente wie Serotonin auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Fütterung zu modulieren, sollten Sie bei der Zubereitung von Stammlösungen Folgendes beachten. Wir bereiten in der Regel eine 50-fache Brühe für wasserlösliche Arzneimittel vor und fügen 3 μl zu jeder Vertiefung hinzu (1:50), aber auch andere Stammkonzentrationen (100x, 300x) funktionieren. Wenn die Arzneimittel jedoch in anderen Lösungsmitteln als Wasser (z. B. DMSO) verdünnt werden, sollte die Endkonzentration 0,5 % nicht überschreiten. Lösungsmittel werden schnell schädlich für C. elegans. Daher müssen Stammlösungen von Arzneimitteln, die in organischen Lösungsmitteln wie DMSO gelöst sind, 300x oder höher sein.
Bewertung von lebenden und toten Würmern:
Die Bestimmung von lebenden und toten Tieren basiert auf der Bewegung des Wurms. Es wird starkes Licht, vor allem blaues Licht, verwendet, weil es die Tiere in Bewegung versetzt. Darüber hinaus zeigt die Bewertung der Anzahl der Tiere pro Vertiefung, ob es zu Übersterblichkeit kommt. Übermäßige Todesfälle können bei giftigen Substanzen oder hohen Konzentrationen (>0,5 %) verschiedener Lösungsmittel, einschließlich DMSO, auftreten. In der Regel sollte es weniger als 1:100 (1%) tote Tiere geben. Die Platten können auf dem Mikrotiter-Plattenschüttler 30 s bei 800 U/min geschüttelt werden, wenn sich die Nahrung abgesetzt hat und die Population schwer zu zählen ist. Brunnen mit Männchen oder mehr als 16 Würmern ignorieren (siehe Probleme).
Mögliche Probleme:
Unzureichendes Schütteln:
In einem flüssigen Medium können sich Bakterien leicht verklumpen und sich am Boden der Vertiefungen absetzen. Unserer Erfahrung nach kann ein Schütteln von weniger als 20 Minuten dazu führen, dass bakterielle Klumpen nicht aufgebrochen und wieder suspendiert werden, was zu ungenauen OD600-Messungen führt. OD600-Messungen in Gegenwart von Bakterienklumpen unterschätzen die Bakterienkonzentration. Zu hohe Einstellungen des Schüttlers können dazu führen, dass die Flüssigkeit an der Versiegelung kleben bleibt. Sobald die Versiegelung für den OD600-Messwert entfernt wird, führt die an der Versiegelung haftende Flüssigkeit zu einem niedrigeren OD600-Messwert . Wenn sich Flüssigkeit auf dem Versiegelungsmittel befindet, drehen Sie die Platte schnell bei niedriger Geschwindigkeit (500-1.000 U/min) und schütteln Sie sie erneut 5 Minuten lang. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie, wie für die Messungen an Tag 1 und Tag 4 angegeben, innerhalb von 10 Minuten nach dem Schütteln der Platten ablesen, um zu verhindern, dass sich die Bakterien absetzen.
Unterschiedliche absolute Werte für die Nahrungsaufnahme zwischen den Experimenten:
Trotz unserer Bemühungen, die bakteriellen Präparate zu standardisieren, unterscheiden sie sich oft in einer Weise, die sich auf die Nahrungsaufnahme bei Würmern auswirkt. Zum Beispiel unterscheiden sich Bakterien aufgrund ihres sich teilenden Zustands in der Größe, je nachdem, ob sie in der logarithmischen Wachstumsphase oder in der stationären Phase geerntet wurden, wobei die logarithmischen Bakterien größer sind. Da bei OD600-Messungen nicht zwischen den Größen unterschieden wird, können die Unterschiede in der Bakteriengröße aufgrund der Phase, in der die Bakterien geerntet wurden, zu den offensichtlichen Unterschieden in der basalen Nahrungsaufnahme zwischen bakteriellen Präparaten führen. Der beste Weg, zwischen Experimenten zu vergleichen, besteht darin, immer eine unbehandelte N2-Kontrollpopulation einzubeziehen und die Ergebnisse auf diese N2-Population zu normalisieren.
Crowding-Effekte:
Die Bakterienkonzentration in diesem Protokoll reicht aus, um den OD600 für 2-16 Würmer pro Vertiefung für ~72 h im linearen Bereich zu halten. Abhängig vom interessierenden Medikament kann eine Vertiefung mit mehr als 16 Würmern die Bakterienkonzentration vor der zweiten Messung verringern. Wir haben auch festgestellt, dass Brunnen mit einem Tier tendenziell unzuverlässig sind. Der Lysefaktor überwiegt das, was ein einzelner Wurm frisst. Kleinere Fehler bei der Bestimmung des Lysefaktors betreffen daher überproportional Vertiefungen mit weniger Würmern.
Wir empfehlen, Bohrlöcher von statistischen Analysen auszunehmen, wenn eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist. Es gibt Männchen im Brunnen (wir haben keine Daten, die die Nahrungsaufnahme zwischen Männchen und Hermaphroditen vergleichen); Es befinden sich weniger als 2 Würmer im Brunnen oder mehr als 16 Würmer im Brunnen; Die Würmer sind bei der zweiten Lesung tot; oder ob es Nachkommen in den Vertiefungen gibt, weil die FUdR versagt hat. FUdR ist wärmeempfindlich und wird bereits bei Temperaturen von 37 °C inaktiviert. FUdR immer in Wasser mit Raumtemperatur auftauen.
Negative Werte für die Nahrungsaufnahme:
Die Werte für die Nahrungsaufnahme sind gelegentlich negativ, was darauf hindeutet, dass an Tag 4 mehr Nahrung zu sich genommen wird als an Tag 1. Negative Werte für die Nahrungsaufnahme können auf einen der folgenden Faktoren hinweisen: eine hohe Selbstlyserate , die möglicherweise durch ein zugesetztes Medikament verursacht wird, das auf die Bakterien wirkt, oder negative Werte für die Nahrungsaufnahme, die darauf hindeuten können, dass der Brunnen kontaminiert ist und etwas anderes als Würmer wächst. Auch die Selbstlyseraten steigen mit zunehmendem Alter der Bakterien; Daher empfehlen wir, Bakterien zu verwenden, die nicht älter als eine Woche sind. Es wurde ein Medikament hinzugefügt, das im Laufe der Zeit ausfällt und den OD600-Wert beeinflusst. Unzureichendes Schütteln an Tag 1 kann aufgrund von Bakterienklumpen zu einem niedrigeren OD600-Wert führen. Die Würmer wurden hypoxischem Stress ausgesetzt. Dies tritt auf, wenn das Boden-Luft-Verhältnis nicht ausreicht, um einen Sauerstoffaustausch zu ermöglichen. Verwenden Sie die spezielle 96-Well-Platte in Materialien und überschreiten Sie nicht 150 μl (120 μl + 30 μl FUdR) pro Well. Der Abstand zwischen der Oberfläche des Brunnens und dem Boden, wo die Würmer leben, bestimmt die Sauerstoffkonzentration.
Begrenzungen:
Dieser Assay ist auf Flüssigkulturen beschränkt. Das an festen Platten beobachtete Fressverhalten, wie z. B. das Auf- und Verlassen von Rasenflächen, kann mit dem Assay nicht beurteilt werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten uns bei Xiaolan Ye bedanken, da dieses Protokoll als Ergebnis einer Beobachtung entwickelt wurde, die sie ursprünglich gemacht hat. Wir danken allen ehemaligen und aktuellen Mitgliedern des Petrascheck-Labors für ihre Hilfe bei der Entwicklung und Optimierung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde gefördert durch R21 AG080376 (an M.P.). Einige Stämme wurden vom CGC zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.
Materials
| Amphotericin B | RPI | A40030-0.1 | solvent: EtOH |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | solvent: water |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | use to make NGM plates |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | 46-100-RG | solvent: water |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | 40 µm to remove adults |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 02101380-CF | 5 mg/mL stock |
| Difco, Agar, Bacteriological | BD Biosciences | 214510 | use to make NGM plates |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich | F0503 | to sterilize worms on L4 |
| Luria Broth | RPI | L24045-1000.0 | open capsule, mix with 1 L of water, autoclave |
| M9 Buffer | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 15 g Na2HPO4*12H2O (FW: 358) 3 g KH2PO4 (FW: 136) 5 g NaCl (FW: 58), 0.25 g MgSO4*7H2O (FW: 246) autoclave |
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| Microplate Sealer | Fisher Scientific | 236707 | |
| OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Plate 96-well | Falcon | 351172 | |
| Plate reader | Tecan | 30016056 | use 600 nm filter lens |
| Potassium Citrate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 268.8 g Potassium citrate tribasic monohydrate (FW: 324) 26.3 g citric acid monohydrate (FW: 210) 900 mL of dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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| Potassium Phosphate, 1 M , pH 6 | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 136 g KH2PO4 (FW: 136) 900 mL dH2O pH to 6 using 5 M KOH autoclave |
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| S-Basal | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 5.9 g NaCl (FW: 58) 50 mL 1 M potassium phosphate (pH 6) add 900 mL dH2O autoclave, cool to 55 °C |
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| S-Complete | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: Add to 1 L of S-basal (cooled to 55 °C or RT) 10 mL of 1 M potassium citrate pH 6, 10 mL of trace metal solutions 3 mL of 1 M CaCl2 3 mL of 1 M MgSO4 |
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| Serotonin hydrochloride | Thermo Scientific | AAB2126309 | used at 5 mM |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653-5KG | to make buffers and NGM plates |
| Terrific Broth | Thermo Scientific | J75856-A1 | 12.5 g in 250 mL of water, autoclave |
| Titer plate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | shaken at 800 rpm, depends on shaker |
| Trace Metals Solution | Laboratory Prepared | Store in sterile conditions at room temperature To prepare 1 L: 1.86 g Na2EDTA (FW: 372.24) 0.69 g FeSO4*7H2O (FW: 278) 0.20 g MnCl2*4H2O (FW: 198) 0.29 g ZnSO4*7H2O (FW: 287) 0.016 g CuSO4 (FW: 158) autoclave wrap in aluminum foil to keep in the dark |
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