יצירת רשתית עצבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מערכת אינדוקציה תלת-ממדית אופטימלית של הרשתית העצבית המפחיתה את ההידבקות והאיחוי של אורגנואידים ברשתית עם חזרתיות ויעילות גבוהות.
Abstract
רטינופתיה היא אחד הגורמים העיקריים לעיוורון ברחבי העולם. חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן של רטינופתיה. למרבה הצער, מחסומים אתיים מעכבים איסוף ראיות מבני אדם. לאחרונה, מחקרים רבים הראו כי תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSCs) יכולים להיות ממוינים לאורגנואידים ברשתית (ROs) באמצעות פרוטוקולי אינדוקציה שונים, שיש להם פוטנציאל עצום ברטינופתיה למידול מחלות, סינון תרופות וטיפולים מבוססי תאי גזע. מחקר זה מתאר פרוטוקול אינדוקציה אופטימלי ליצירת רשתית עצבית (NR) המפחיתה באופן משמעותי את ההסתברות לשלפוחית ואיחוי, ומגדילה את שיעור ההצלחה של הייצור עד היום ה-60. בהתבסס על היכולת של PSCs לארגן מחדש את עצמם לאחר דיסוציאציה, בשילוב עם גורמים משלימים מסוימים, שיטה חדשה זו יכולה באופן ספציפי להניע התמיינות NR. יתר על כן, הגישה אינה מסובכת, חסכונית, מפגינה חזרתיות ויעילות ראויות לציון, מציגה סיכויים מעודדים למודלים מותאמים אישית של מחלות רשתית, ומספקת מאגר תאים בשפע ליישומים כגון תרפיה תאית, בדיקות סקר תרופתיות ובדיקות ריפוי גנטי.
Introduction
העין משמשת כמקור המידע העיקרי בין איברי החישה האנושיים, כאשר הרשתית היא הרקמה החישה הראייתית העיקרית בעיני יונקים1. רטינופתיה עומדת כאחד הגורמים העולמיים העיקריים למחלות עיניים, המובילות לעיוורון2. כ-2.85 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים בדרגות שונות של ליקוי ראייה עקב רטינופתיה3. כתוצאה מכך, חקירת הפתוגנזה שלה חיונית לאבחון מוקדם וטיפול בזמן. רוב המחקרים על רטינופתיה אנושית התמקדו בעיקר במודלים של בעלי חיים 4,5,6. עם זאת, הרשתית האנושית היא רקמה מורכבת ורב-שכבתית הכוללת סוגי תאים שונים. תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) ומערכות מודל של בעלי חיים בדרך כלל אינן מצליחות לשחזר נאמנה את ההתפתחות המרחבית-זמנית הרגילה ואת חילוף החומרים התרופתי של הרשתית האנושית הטבעית 7,8.
לאחרונה, טכניקות תרבית תלת-ממדיות התפתחו כדי ליצור איברים דמויי רקמות מתאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs)9,10. אורגנואידים ברשתית (ROs) הנוצרים מתאי PSC אנושיים במערכת תרבית תרחיף תלת-ממדית לא רק מכילים שבעה סוגי תאי רשתית, אלא גם מציגים מבנה מרובד מובהק הדומה לרשתית האנושית in vivo 11,12,13. ROs שמקורם ב-PSC בבני אדם צברו פופולריות וזמינות נרחבת וכיום הם המודלים הטובים ביותר במבחנה לחקר ההתפתחות והמחלות של הרשתית האנושית14,15. במהלך העשורים האחרונים, חוקרים רבים הוכיחו כי PSCs אנושיים, כולל תאי גזע עובריים (ESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), יכולים להתמיין לתאי RO באמצעות פרוטוקולי אינדוקציה שונים. התקדמות זו טומנת בחובה פוטנציאל עצום ברטינופתיה למידול מחלות, בדיקות סקר לתרופות וטיפולים מבוססי תאי גזע 16,17,18.
עם זאת, יצירת הרשתית העצבית (NR) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSC) היא תהליך מורכב, מסורבל וגוזל זמן. יתר על כן, שינויים בין אצווה לאצווה באורגנואידים של רקמות עשויים להוביל לשכפול נמוך יותר של תוצאות19,20. גורמים פנימיים וחיצוניים רבים יכולים להשפיע על התשואה של אורגנואידים ברשתית (ROs), כגון מספר או מינים של תאים התחלתיים ושימוש בגורמי שעתוק ותרכובות מולקולות קטנות 21,22,23. מאז RO האנושי הראשון נוצר על ידי מעבדת סאסאי11, הוצעו שינויים מרובים במהלך השנים כדי לשפר את הקלות והיעילות של תהליך האינדוקציה 13,21,24,25. למרבה הצער, עד כה, לא נקבע פרוטוקול תקן זהב לייצור ROs בכל המעבדות. ואכן, קיימת מידה מסוימת של אי התאמה ב- ROs הנובעת משיטות אינדוקציה שונות, כמו גם שונות רבה בביטוי סמני הרשתית והחוסן של המבנה שלהם22,26. סוגיות אלה עלולות לסבך מאוד את איסוף הדגימות ואת פענוח ממצאי המחקר. לכן, יש צורך בפרוטוקול בידול מאוחד וחזק יותר כדי למקסם את היעילות עם הטרוגניות מינימלית של דור RO.
מחקר זה מתאר פרוטוקול אינדוקציה אופטימלי המבוסס על שילוב של Kuwahara et al.12 ו- Döpper et al.27 עם הוראות מפורטות. השיטה החדשה מפחיתה באופן משמעותי את ההסתברות של שלפוחית אורגנואיד ואיחוי, ומגדילה את שיעור ההצלחה של יצירת NR. פיתוח זה טומן בחובו הבטחה גדולה עבור מודלים של מחלות, בדיקות סקר תרופתיות ויישומי תרפיה תאית להפרעות רשתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
ROs אנושיים יכולים לשחזר באופן מרחבי וזמני את התפתחות הרשתית העוברית, ו- ROs מוקדמים מפגינים רמה גבוהה של דמיון לרשתית העובר בשלבים מקבילים של התפתחות15. במונחים של מורפולוגיה של רקמות וביטוי מולקולרי, RO אנושי משקף באופן הדוק את מצב הצמיחה בפועל של רקמת הרשתית, ומספק הזדמנויות עצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
- Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
- Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
- Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
- Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
- Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
- Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
- Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
- Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
- Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
- Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
- Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
