מדידת אורך זנב Poly A מזחלי דרוזופילה מוח וקו תאים
Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה יעילה ואמינה לכימות אורך הפולי(A) של הגן המעניין ממערכת העצבים דרוזופילה , שניתן להתאים בקלות לרקמות או סוגי תאים ממינים אחרים.
Abstract
פוליאדנילציה היא שינוי חיוני לאחר שעתוק המוסיף זנבות פולי(A) לקצה 3′ של מולקולות mRNA. אורך זנב הפולי(A) מווסת היטב על ידי תהליכים תאיים. דיסרגולציה של פוליאדנילציה mRNA נקשרה לביטוי גנים חריג ולמחלות שונות, כולל סרטן, הפרעות נוירולוגיות והפרעות התפתחותיות. לכן, הבנת הדינמיקה של פוליאדנילציה חיונית לפענוח המורכבות של עיבוד mRNA ובקרת גנים לאחר שעתוק.
מאמר זה מציג שיטה למדידת אורכי זנב פולי(A) בדגימות RNA שבודדו ממוחות זחלי דרוזופילה ומתאי דרוזופילה שניידר S2. השתמשנו בגישת הזנב גואנוזין/אינוזין (G/I), הכוללת הוספה אנזימטית של שאריות G/I בקצה ה-3′ של mRNA באמצעות פולימראז שמרים (A). שינוי זה מגן על קצה ה-3′ של הרנ”א מפני התפרקות אנזימטית. זנבות הפולי(A) המוגנים באורך מלא מתועתקים לאחור באמצעות פריימר אנטיסנס אוניברסלי. לאחר מכן, הגברה PCR מבוצעת באמצעות אוליגו ספציפי לגן המכוון לגן המעניין, יחד עם אוליגו רצף אוניברסלי המשמש לשעתוק לאחור.
זה מייצר תוצרי PCR המקיפים את זנבות הפולי(A) של הגן המעניין. מכיוון שפוליאדנילציה אינה שינוי אחיד וגורמת לזנבות באורכים משתנים, מוצרי ה-PCR מציגים מגוון גדלים, מה שמוביל לדפוס מריחה על ג’ל אגרוז. לבסוף, מוצרי ה- PCR נתונים לאלקטרופורזה של ג’ל נימי ברזולוציה גבוהה, ואחריה כימות באמצעות הגדלים של מוצרי ה- PCR poly(A) ומוצר ה- PCR הספציפי לגן. טכניקה זו מציעה כלי פשוט ואמין לניתוח אורכי זנב פולי(A), ומאפשרת לנו לקבל תובנות עמוקות יותר על המנגנונים המורכבים השולטים בוויסות mRNA.
Introduction
רוב ה-mRNA האיקריוטי עובר פוליאדנילציה לאחר שעתוק בנקודת הסיום של 3′ בגרעין על ידי תוספת של אדנוזין ללא תבנית על ידי פולימראזות פולי(A) קנוניות. זנב פולי(A) שלם הוא חיוני לאורך מחזור החיים של mRNA, מכיוון שהוא חיוני לייצוא גרעיני של mRNA1, מאפשר אינטראקציה עם חלבונים קושרי פולי(A) כדי לשפר את יעילות התרגום2, ומקנה עמידות בפני פירוק3. במקרים מסוימים, זנב פולי(A) יכול גם לעבור הארכה בציטופלסמה, בסיוע פולימראז (A) לא קנוני4. בציטופלסמה, אורך הזנב של פולי (A) משתנה באופן דינמי ומשפיע על תוחלת החיים של מולקולת ה-mRNA. פולימרזות ודדנילזות רבות ידועות באפנון אורך הזנב 5,6,7. לדוגמה, קיצור זנבות פולי(A) מתואם עם דיכוי תרגומי, ואילו התארכות זנבות פולי(A) משפרת את התרגום 8,9.
מחקרים גנומיים מצטברים הוכיחו את המשמעות הבסיסית של אורך הזנב הפולי(A) על פני היבטים שונים של הביולוגיה האיקריוטית. זה כולל תפקידים בהתפתחות תאי נבט, התפתחות עוברית מוקדמת, פלסטיות סינפטית עצבית ללמידה וזיכרון, והתגובה הדלקתית10. פותחו שיטות ומבדקים רבים למדידת אורכי זנב פולי(A). לדוגמה, בדיקת RNase H/oligo(dT) מנצלת את RNase H בנוכחות או היעדר oligo(dT) כדי לחקור את אורך הזנב של poly(A)11,12. שיטות אחרות לחקר זנב פולי(A) כוללות הגברה PCR של קצוות 3′ כגון הגברה מהירה של cDNA קצוות בדיקת poly(A) (RACE-PAT)12,13 ובדיקת poly(A) בתיווך ליגאז (LM-PAT)14. שינויים נוספים בבדיקת PAT כוללים ePAT15 ו- sPAT16. זנב G אנזימטי17,18 או זנב G/I של קצה 3′ הן וריאציות אחרות של מבחן PAT. שינוי נוסף של טכניקות אלה כולל שימוש בפריימרים המסומנים באופן פלואורסצנטי יחד עם אלקטרופורזה של ג’ל נימי לאנליזה ברזולוציה גבוהה, המכונה מבחן פולי(A) ברזולוציה גבוהה (Hire-PAT)19. בדיקות מונחות PCR אלה מאפשרות כימות אורך פולי(A) מהיר ובעל רגישות גבוהה.
עם הפיתוח של ריצוף הדור הבא, שיטת ריצוף בתפוקה גבוהה, כגון PAL-seq20 ו- TAIL-seq21, מאפשרת ניתוח פוליאדנילציה בקנה מידה רחב של תעתוק. עם זאת, שיטות אלה מספקות רק קריאות רצף קצרות של 36-51 נוקלאוטידים. לכן, FLAM-Seq22 פותח עבור פרופיל אורך זנב גלובלי של mRNA באורך מלא ומספק קריאות ארוכות. טכנולוגיית ננופור23 מספקת ריצוף RNA ישיר או cDNA ישיר שאינו תלוי ב-PCR עבור הערכות אורך זנב פולי(A). עם זאת, שיטות אלה בעלות תפוקה גבוהה אינן נטולות מגבלות. הם דורשים כמויות גדולות של חומרי התחלה, הם יקרים וגוזלים זמן. יתר על כן, ניתוח תמלילים נדירים יכול להיות מאתגר ביותר עם שיטות תפוקה גבוהה, ושיטות מבוססות PCR בתפוקה נמוכה עדיין מספקות יתרון כאשר יש צורך לנתח מספר קטן של תמלילים, לניסויי פיילוט ותיקוף של שיטות אחרות.
לאחרונה הוכחנו כי Dscam1 mRNA מכיל זנבות פולי(A) קצרים בדרוזופילה, מה שמחייב קשירה לא קנונית של החלבון הקושר פולי(A) ציטופלזמי על Dscam1 3’UTR באמצעות שיטת זנב G/I24. כאן אנו מספקים הליך יעיל להכנת רקמות וכימות אורך פולי(A) של mRNA ממערכת העצבים דרוזופילה ותאי דרוזופילה S2.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הטכניקה לנתח את מוח הזחל Drosophila משלב 3rdinstar נודד, כמו גם את הכנת הדגימה מתאי Drosophila S2. בשל אופיים העלוב של mRNAs, איסוף הדגימות דורש זהירות יתרה. במקרה של דיסקציה מוחית של הזחל, המוח לא אמור להיפגע במהלך הבידוד ואין לשמור אותו בתמיסה למשך זמן ממושך. שמירה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי R01NS116463 לג’יי.קיי., ומתקן הליבה של הדמיה תאית ומולקולרית באוניברסיטת נבאדה, רינו, אשר נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות P20GM103650 ושימש למחקר שדווח במחקר זה.
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O’Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3′ RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3′-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3′ end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects’ RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3′ UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3′ trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
