Meting van Poly A-staartlengte van Drosophila-larvehersenen en cellijn
Summary
Het protocol beschrijft een efficiënte en betrouwbare methode voor het kwantificeren van de poly(A)-lengte van het gen van belang uit het Drosophila-zenuwstelsel , die gemakkelijk kan worden aangepast aan weefsels of celtypen van andere soorten.
Abstract
Polyadenylering is een cruciale posttranscriptionele modificatie die poly(A)-staarten toevoegt aan het 3′-uiteinde van mRNA-moleculen. De lengte van de poly(A)-staart wordt strak gereguleerd door cellulaire processen. Ontregeling van mRNA-polyadenylering is in verband gebracht met abnormale genexpressie en verschillende ziekten, waaronder kanker, neurologische aandoeningen en ontwikkelingsafwijkingen. Daarom is het begrijpen van de dynamiek van polyadenylatie van vitaal belang voor het ontrafelen van de complexiteit van mRNA-verwerking en posttranscriptionele genregulatie.
Dit artikel presenteert een methode voor het meten van poly(A)-staartlengtes in RNA-monsters geïsoleerd uit Drosophila-larvale hersenen en Drosophila Schneider S2-cellen. We gebruikten de guanosine/inosine (G/I) tailing-benadering, waarbij G/I-residuen enzymatisch worden toegevoegd aan het 3′-uiteinde van mRNA met behulp van gistpoly(A)-polymerase. Deze modificatie beschermt het 3′-uiteinde van het RNA tegen enzymatische afbraak. De beschermde poly(A)-staarten over de volledige lengte worden vervolgens omgekeerd getranscribeerd met behulp van een universele antisense-primer. Vervolgens wordt PCR-amplificatie uitgevoerd met behulp van een genspecifieke oligo die zich richt op het gen van belang, samen met een universele sequentie-oligo die wordt gebruikt voor reverse transcriptie.
Dit genereert PCR-producten die de poly(A)-staarten van het gen in kwestie omvatten. Aangezien polyadenylering geen uniforme modificatie is en resulteert in staarten van verschillende lengtes, vertonen de PCR-producten een reeks maten, wat leidt tot een uitstrijkpatroon op agarosegel. Ten slotte worden de PCR-producten onderworpen aan capillaire gelelektroforese met hoge resolutie, gevolgd door kwantificering met behulp van de afmetingen van de poly(A) PCR-producten en het genspecifieke PCR-product. Deze techniek biedt een eenvoudig en betrouwbaar hulpmiddel voor het analyseren van poly(A)-staartlengtes, waardoor we diepere inzichten kunnen krijgen in de ingewikkelde mechanismen die de mRNA-regulatie regelen.
Introduction
De meeste eukaryote mRNA’s worden posttranscriptioneel gepolyadenyleerd aan hun 3′ eindpunt in de kern door toevoeging van niet-getemplatede adenosines door canonieke poly(A)-polymerasen. Een intacte poly(A)-staart is cruciaal gedurende de hele levenscyclus van mRNA, omdat het essentieel is voor de nucleaire export van mRNA1, de interactie met poly(A)-bindende eiwitten vergemakkelijkt om de translationele efficiëntie te verbeteren2 en weerstand biedt tegen afbraak3. In bepaalde gevallen kan de poly(A)-staart ook extensie ondergaan in het cytoplasma, gefaciliteerd door niet-canonieke poly(A)-polymerasen4. In het cytoplasma verandert de lengte van de poly (A) staart dynamisch en beïnvloedt de levensduur van het mRNA-molecuul. Van talrijke polymerasen en deadenylasen is bekend dat ze de staartlengte 5,6,7 moduleren. De verkorting van poly(A)-staarten correleert bijvoorbeeld met translatie-repressie, terwijl de verlenging van poly(A)-staarten de translatie verbetert 8,9.
Accumulerende genomische studies hebben de fundamentele betekenis van de poly(A)-staartlengte aangetoond in verschillende facetten van de eukaryote biologie. Dit omvat rollen in de ontwikkeling van kiemcellen, vroege embryonale ontwikkeling, neuronale synaptische plasticiteit voor leren en geheugen, en de ontstekingsreactie10. Er zijn tal van methoden en assays ontwikkeld voor het meten van poly(A)-staartlengtes. De RNase H/oligo(dT)-assay maakt bijvoorbeeld gebruik van RNase H in de aan- of afwezigheid van oligo(dT) om poly(A)-staartlengte11,12 te bestuderen. Andere methoden om poly(A)-staart te bestuderen zijn onder meer de PCR-amplificatie van 3′-uiteinden, zoals snelle amplificatie van cDNA-uiteinden, poly(A)-test (RACE-PAT)12,13 en de ligase-gemedieerde poly(A)-test (LM-PAT)14. Verdere wijzigingen van de PAT-test zijn onder meer ePAT15 en sPAT16. Enzymatische G-tailing17,18 of G/I-tailing van het 3′-uiteinde zijn andere variaties van de PAT-test. Verdere modificatie van deze technieken omvat het gebruik van fluorescerend gelabelde primers samen met capillaire gelelektroforese voor analyse met hoge resolutie, ook wel de hoge-resolutie poly(A)-test (Hire-PAT) genoemd19. Deze PCR-gestuurde assays maken een snelle en zeer gevoelige kwantificering van poly(A)-lengtes mogelijk.
Met de ontwikkeling van sequencing van de volgende generatie maakt een high-throughput sequencingmethode, zoals PAL-seq20 en TAIL-seq21, polyadenylatieanalyses op transcriptoombrede schaal mogelijk. Deze methoden bieden echter slechts korte sequentiemetingen van 36-51 nucleotiden. Daarom is FLAM-Seq22 ontwikkeld voor globale staartlengteprofilering van mRNA van volledige lengte en biedt het lange lezingen. Nanopore-technologie23 biedt PCR-onafhankelijke, directe RNA- of directe cDNA-sequencing voor schattingen van poly(A)-staartlengtes. Deze high-throughput methoden zijn echter niet zonder beperkingen. Ze vereisen grote hoeveelheden uitgangsmateriaal, zijn duur en tijdrovend. Bovendien kan het analyseren van zeldzame transcripten een enorme uitdaging zijn met high-throughput-methoden, en PCR-gebaseerde methoden met lage doorvoer bieden nog steeds een voordeel wanneer een klein aantal transcripten moet worden geanalyseerd, voor pilot-experimenten en validatie van andere methoden.
We hebben onlangs aangetoond dat Dscam1-mRNA’s korte poly(A)-staarten bevatten in Drosophila, wat een niet-canonieke binding van het cytoplasmatische poly(A)-bindende eiwit op Dscam1 3’UTR vereist met behulp van de G/I-tailing-methode24. Hier bieden we een gestroomlijnde procedure voor weefselvoorbereiding en het kwantificeren van poly(A)-lengte van mRNA’s van het Drosophila-zenuwstelsel en Drosophila S2-cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we de techniek om het larvale brein van Drosophila te ontleden uit het zwervende 3e instar-stadium, evenals de monstervoorbereiding van Drosophila S2-cellen. Vanwege de labiele aard van mRNA’s vereist het verzamelen van monsters extra voorzichtigheid. Voor larvale hersendissectie mogen de hersenen niet worden beschadigd tijdens isolatie en mogen ze niet voor langere tijd in oplossing worden bewaard. Het is essentieel om de dissectietijd te beperken tot 8-10 minuten…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 aan JK, en de Cellular and Molecular Imaging Core-faciliteit aan de Universiteit van Nevada, Reno, die werd ondersteund door National Institutes of Health Grant P20GM103650 en gebruikt voor onderzoek dat in deze studie werd gerapporteerd.
Materials
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435 (2018).
- Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
- Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622 (2021).
- Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
- Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
- Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression – Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
- Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
- Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
- Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
- Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
- Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
- Salles, F. J., Darrow, A. L., O’Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
- Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
- Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3′ RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
- Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
- Martin, G., Keller, W. Tailing and 3′-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
- Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57 (2001).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
- Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3′ end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
- Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
- Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
- Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
- Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects’ RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294 (2015).
- Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3′ UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
- Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3′ trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).
