直接观察和自动测量对丁香假单胞菌 pv 的气孔反应。番茄拟南芥中的DC3000
Summary
在这里，我们提出了一种简单的方法，用于直接观察和自动测量 拟南芥对细菌入侵的气孔反应。该方法利用便携式气孔成像设备，以及专为设备捕获的叶片图像而设计的图像分析管道。
Abstract
气孔是在植物叶片表皮中发现的微小孔隙。气孔的调节不仅对于平衡光合作用和蒸腾水分损失的二氧化碳吸收至关重要，而且对于限制细菌入侵也至关重要。当植物在识别微生物时关闭气孔，致病细菌，如 丁香假单胞菌 pv。 番茄 DC3000 （Pto），重新打开闭合的气孔以进入叶片内部。在评估气孔对细菌入侵反应的常规测定中，将叶表皮皮、叶盘或分离的叶漂浮在细菌悬浮液上，然后在显微镜下观察气孔，然后手动测量气孔孔径。然而，这些测定很麻烦，可能无法反映附着在植物上的叶子对自然细菌入侵的气孔反应。最近，开发了一种便携式成像设备，可以通过捏住叶子而不将其从植物上分离来观察气孔，以及基于深度学习的图像分析管道，旨在从设备捕获的叶子图像中自动测量气孔孔径。在这里，在这些技术进步的基础上，介绍了一种评估 拟南芥 细菌入侵的气孔反应的新方法。该方法包括三个简单的步骤：模拟自然感染过程的 Pto 喷雾接种，使用便携式成像设备直接观察 Pto接种植物叶子上的气孔，以及通过图像分析管道自动测量气孔径。该方法成功地用于在 Pto 侵袭期间在密切模拟天然植物-细菌相互作用的条件下气孔关闭和重新开放。
Introduction
气孔是植物叶子和其他地上部分表面被一对保卫细胞包围的微观孔隙。在不断变化的环境中，气孔的调节是植物控制光合作用所需的二氧化碳吸收的核心，而代价是通过蒸腾作用流失水分。因此，气孔孔径的量化有助于了解植物的环境适应性。然而，量化气孔本质上是耗时和繁琐的，因为它需要人工来发现和测量显微镜捕获的叶片图像中的气孔。为了规避这些限制，已经开发了各种方法来促进拟南芥气孔的量化，拟南芥是一种广泛用于研究气孔生物学的模式植物1,2,3,4,5,6。例如，孔径计可用于测量蒸腾速率，作为气孔导度的指标。然而，该方法不能提供关于确定气孔导率的气孔数和孔径的直接信息。一些研究使用共聚焦显微镜技术，使用荧光肌动蛋白标记物、荧光染料或细胞壁自发荧光1、2、3、4、5 突出气孔。虽然这些方法有助于气孔的检测，但操作共聚焦显微镜设施和制备显微镜样品的成本可能会成为常规应用的障碍。在Sai等人的一项开创性工作中，开发了一种深度神经网络模型，用于从拟南芥表皮剥离的明场显微图像中自动测量气孔孔径6。然而，这项创新并没有免除研究人员为显微镜观察准备表皮剥离的任务。最近，通过开发一种便携式成像设备克服了这一障碍，该设备可以通过捏住拟南芥的叶子来观察气孔，以及基于深度学习的图像分析管道，该管道可以从设备捕获的叶子图像中自动测量气孔孔径7。
气孔有助于植物对细菌病原体的先天免疫力。这种免疫反应的关键是气孔闭合，它限制细菌通过微观孔进入叶片内部，细菌病原体在那里增殖并引起疾病8.通过质膜定位模式识别受体 （PRR） 识别微生物相关分子模式 （MAMP） 时，诱导气孔闭合，MAMP 是一类微生物通常共有的免疫原性分子9。细菌鞭毛蛋白的 22 个氨基酸表位称为 flg22，是一种典型的 MAMP，它通过被 PRR FLS210 识别来诱导气孔闭合。作为对策，细菌病原体如丁香假单胞菌pv。番茄DC3000 （Pto） 和 Xanthomonas campestris pv.囊泡已经进化出毒力机制来重新打开气孔 9,11,12。这些对细菌病原体的气孔反应已在测定中进行了常规分析，其中叶表皮皮、叶盘或分离的叶子漂浮在细菌悬浮液上，然后在显微镜下观察气孔，然后手动测量气孔孔径。然而，这些测定很麻烦，可能无法反映附着在植物上的叶子中发生的对自然细菌入侵的气孔反应。
在这里，提出了一种简单的方法，用于在密切模拟自然植物-细菌相互作用的条件下研究 Pto 入侵期间的气孔关闭和重新开放。该方法利用便携式成像设备直接观察附着在接种Pto的植物上的叶片上的拟南芥气孔，以及用于自动测量气孔孔径的图像分析管道。
Protocol
Representative Results
Discussion
以前的研究使用表皮剥离、叶盘或分离的叶子来研究气孔对细菌入侵的反应 9,11,12。相比之下，本研究提出的方法利用便携式气孔成像设备直接观察喷洒接种Pto后附着在植物上的叶子上的气孔，模拟细菌入侵的自然条件。此外，由于该方法不涉及破坏性的样品制备过程，例如叶片脱落、叶盘切除和表皮剥离，因此可以避?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢研究项目“通过组装植物-微生物全息生物共同创造植物适应性状”的所有成员进行了富有成效的讨论。这项工作得到了变革性研究领域的补助金（21H05151 和 21H05149 到 A.M. 和 21H05152 到 Y.T.）和挑战性探索性研究的补助金（22K19178 到 A.M.）的支持。
Materials
| Agar | Nakarai tesque | 01028-85 | |
| Airbrush kits | ANEST IWATA | MX2900 | Accessory kits for SPRINT JET |
| Biotron | Nippon Medical & Chemical Instruments | LPH-411S | Plant Growth Chamber with white fluorescent light |
| Glycerol | Wako | 072-00626 | |
| Half tray | Sakata | 72000113 | A set of tray and lid |
| Hyponex | Hyponex | No catalogue number available | Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants |
| Image J | Natinal Institute of Health | Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | Used for manual measurement of stomatal aperture |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | For MES-KOH |
| MES | Wako | 343-01621 | For MES-KOH |
| Portable stomatal imaging device | Phytometrics | Order at https://www.phytometrics.jp/ | Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018. |
| Rifampicin | Wako | 185-01003 | Dissolve in DMSO |
| Silwet-L77 | Bio medical science | BMS-SL7755 | silicone surfactant used in spray inoculation |
| SPRINT JET | ANEST IWATA | IS-800 | Airbrush used for spray inoculation |
| SuperMix A | Sakata seed | 72000083 | Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil |
| Tryptone | Nakarai tesque | 35640-95 | |
| Vermiculite G20 | Nittai | No catalogue number available | Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil |
| White fluorescent light | NEC | FHF32EX-N-HX-S | Used for Biotron |
References
- Shimono, M., Higaki, T., Kaku, H., Shibuya, N., Hasezawa, S., Day, B. Quantitative evaluation of stomatal cytoskeletal patterns during the activation of immune signaling in Arabidopsis thaliana. PLoS One. 11, e0159291 (2016).
- Bourdais, G., et al. The use of quantitative imaging to investigate regulators of membrane trafficking in Arabidopsis stomatal closure. Traffic. 20 (2), 168-180 (2019).
- Higaki, T., Kutsuna, N., Hasezawa, S. CARTA-based semi-automatic detection of stomatal regions on an Arabidopsis cotyledon surface. Plant Morphology. 26 (1), 9-12 (2014).
- Eisele, J. F., Fäßler, F., Bürgel, F., Chaban, C. A. A rapid and simple method for microscopy-based stomata analyses. PLoS One. 11, e0164576 (2016).
- Chitraker, R., Melotto, M. Assessing stomatal response to live bacterial cells using whole leaf imaging. Journal of Visualized Experiments. 44, 2185 (2010).
- Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytologist. 238 (2), 904-915 (2023).
- Takagi, M., et al. Image-based quantification of Arabidopsis thaliana stomatal aperture from leaf images. Plant and Cell Physiology. pcad018, (2023).
- Melotto, M., Zhang, L., Oblessuc, P. R., He, S. Y. Stomatal defense a decade later. Plant Physiology. 174 (2), 561-571 (2017).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Zeng, W., He, S. A prominent role of the flagellin receptor FLAGELLIN-SENSING2 in mediating stomatal response to Pseudomonas syringae pv tomato DC3000 in Arabidopsis. Plant Physiology. 153 (3), 1188-1198 (2010).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host and Microbe. 11 (6), 587-596 (2012).
- Raffeiner, M., et al. The Xanthomonas type-III effector XopS stabilizes CaWRKY40a to regulate defense responses and stomatal immunity in pepper (Capsicum annuum). The Plant Cell. 34 (5), 1684-1708 (2022).
- Munemasa, S., Hauser, F., Park, J., Waadt, R., Brandt, B., Schroeder, J. I. Mechanisms of abscisic acid-mediated control of stomatal aperture. Current Opinion in Plant Biology. 28, 154-162 (2015).
- Förster, S., et al. Wounding-induced stomatal closure requires jasmonate-mediated activation of GORK K+ channels by a Ca2+ sensor-kinase CBL1-CIPK5 complex. Developmental Cell. 48 (1), 87-99 (2018).
- Cheng, Y. T., Zhang, L., He, S. Y. Plant-microbe interactions facing environmental challenge. Cell Host and Microbe. 26 (2), 183-192 (2019).
