Vi presenterar ett protokoll för kristallisation av proteiner med hjälp av kristallisationsanläggningen i forskningskomplexet vid Harwell och efterföljande röntgenkristallografisk datainsamling in situ från kristaller i plattorna vid Diamonds Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) strålrör. Vi beskriver provkrav, kristallisationsprotokoll och riktlinjer för datainsamling.
Protokoll för robotproteinkristallisation med hjälp av kristallisationsanläggningen vid Harwell och in situ insamling av rumstemperaturdata från kristallisationsplattor vid Diamond Light Source-strålröret VMXi beskrivs. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att bestämma högkvalitativa rumstemperaturkristallstrukturer från flera kristaller på ett enkelt sätt och ger mycket snabb återkoppling på resultaten av kristallisationsförsök samt möjliggör seriell kristallografi. Värdet av rumstemperaturstrukturer för att förstå proteinstruktur, ligandbindning och dynamik blir alltmer erkänt inom strukturbiologin. Den här pipelinen är tillgänglig för användare från hela världen med flera tillgängliga åtkomstlägen. Kristallisationsexperiment som sätts upp kan avbildas och ses på distans med kristaller som identifieras automatiskt med hjälp av ett maskininlärningsverktyg. Data mäts i ett köbaserat system med upp till 60° rotationsdata från användarvalda kristaller i en platta. Data från alla kristaller inom en viss brunn eller provgrupp slås automatiskt samman med hjälp av xia2.multiplex med utgångarna direkt åtkomliga via ett webbläsargränssnitt.
Röntgenkristallografi är fortfarande ett viktigt verktyg för att förstå proteiners struktur och funktion, vilket ger högupplösta strukturer av proteiner eller deras komplex med till exempel substrat eller läkemedelskandidater. I många fall är det dock fortfarande en betydande flaskhals att få fram kristaller med önskvärda egenskaper – mycket diffrakterande, kristallform som är mottaglig för blötläggning och utan kristallpatologier som tvillingbildning– 1. Eftersom lämpliga kemiska förhållanden för att producera proteinkristaller i allmänhet inte kan förutsägas, är kristallisationsscreening som utforskar tusentals potentiella kemiska blandningar standard, ofta med hjälp av automatisering/robotik för att ställa in skärmar och kristallhotell för övervakning, ofta på distans, av kristallisationsdroppbilderna som registreras.
När kristaller dyker upp måste de vanligtvis skördas från kristallisationsmiljön med hjälp av en nylon- eller Kapton-slinga och sedan överföras till en droppe som innehåller ett kryoskyddsmedel (sökandet efter detta är en ytterligare variabel) innan de fryses till flytande kväve. Dessa ytterligare steg mellan kristallisation och röntgendatainsamling kan bland annat innebära uttorkning av kristallisationsdroppen när dess förseglade miljö bryts, mekaniska påfrestningar på kristallen när den hanteras och skador från kryoskyddsmedlen på kristallgittret (vilket vanligtvis resulterar i ökad mosaikspridning) bland andra faktorer2. Dessutom är kristallskörd tids- och arbetskrävande och kan leda till inhomogenitet mellan prover, särskilt när hud bildas på droppar under skördeprocessen. VMXi-strålröret ger tillgång till användbara data från kristaller som sitter fast på plattan, som annars skulle kasseras för datainsamling.
De allra flesta röntgenkristallstrukturer bestäms vid 100K med hjälp av ovanstående tillvägagångssätt, vilket möjliggör enkel kristalltransport och hantering och ökar kristallens livslängd i röntgenstrålen med storleksordningar. Det finns dock ett ökande intresse för att bestämma strukturer under icke-kryogena förhållanden, det vill säga mycket närmare de fysiologiska förhållanden som är relevanta för proteinfunktion 2,3,4. Detta möjliggör en mycket bättre uppskattning av proteiners dynamiska struktur, undviker aminosyrakonformationer eller slingor som fryses ut i funktionellt icke-relevanta tillstånd5, och gör det möjligt att utforska ligandbindning under förhållanden som ligger mycket närmare dem i proteinets naturliga miljö i cellen och organismen6.
Ett alternativt tillvägagångssätt, implementerat vid strålröret Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) vid Diamond Light Source-synkrotronen, Storbritannien, är att mäta diffraktionsdata direkt från kristaller i den miljö där de har vuxit (dvs. inuti kristallisationsplattan), under omgivande förhållanden och utan störningar 7,8. Detta möjliggör mycket snabb återkoppling från kristallisationsskärmar och optimeringar för att vägleda en användare till en optimal kristallform för deras behov. Det gör det också möjligt att producera högkvalitativa rumstemperaturstrukturer på ett automatiserat sätt9.
Detta protokoll förutsätter att en användare har ett mycket rent proteinprov redo för kristallisation. Vi beskriver användarupplevelsen när det gäller att få tillgång till kristalliseringsanläggningen på Harwell för att producera proteinkristaller och sedan använda strålröret VMXi för datainsamling (figur 1).
Kristallisationsanläggningen i Harwell
Kristallisationsanläggningen vid Harwell (CF) ligger i forskningskomplexet vid Harwell (RCaH) intill diamantljuskällan. Anläggningen erbjuder användarna ett automatiserat laboratorium med hög genomströmning för makromolekylär kristallisation, med hjälp av robotik för kristallisationsscreening, kristalloptimering, kristallavbildning och karakterisering. Genom nära integration med det högautomatiserade VMXi-strålröret har takten för bestämning av rumstemperaturstrukturer accelererat kraftigt och möjliggör karakterisering av nya proteinstrukturer, protein-ligand och DNA-ligandkomplex, samt automatiserad fragmentscreening (figur 1), allt under icke-kryogena förhållanden.
CF-pipelinen är en serie instrument som omfattar nanoliterkristallisationsrobotar9 för kristallisation av lösliga proteiner och membranproteiner, vätskehanteringsrobotar för att förbereda kommersiella kristallisationsskärmar och komplexa anpassade optimeringsskärmar och fyra avbildningsinstrument (ett vid 4 °C och tre vid 20 °C för avbildning av kristallisationsplattor (se materialtabellen). En kamera kan avbilda lipidkubikfasglasplattor (LCP) och en bildgivare är utrustad med multifluorescensoptik (båda vid 20 °C).
Anläggningen används nu i stor utsträckning av ett brett spektrum av akademiska och industriella användare, inklusive Membrane Protein Laboratory (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem-fragmentscreeningsanläggningen 10, MX-strålrören, XFEL-navet samt Rosalind Franklin Institute (RFI). Denna väletablerade och optimerade pipeline har gjort det möjligt att utföra kristallisationsexperiment inom ett brett spektrum av strukturbiologiska projekt. Detta dokument beskriver pipelinen för kristaller avsedda för datainsamling vid VMXi, även om kristaller också kan skördas och kryokylas eller riktas till XChem-pipelinen.
Användaråtkomst tilldelas genom Diamond MX Proposal System (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) och industriella användare stöds genom Diamond Industry Liaison-gruppen. Alla användare kan komma till platsen med sina prover eller plattor, som kan transporteras för hand. Det rekommenderas inte att skicka tallrikar med kurir eftersom vår erfarenhet tyder på att droppar kan röra sig bort från den plats där de matades ut, eller så kan droppar skadas av kristallisationsbehållaren. Alternativt, efter överenskommelse, kan användare skicka sina proteinprover till CF, där personal sätter upp kristallisationsexperiment för deras räkning. Experimenten kan övervakas på distans av användaren genom att antingen logga in på Rock Maker Web i CF eller via ISPyB i VMXi. Åtkomst till CF kan utföras på ett iterativt sätt baserat på röntgendiffraktionsresultaten som samlats in på Diamond.
Strålrör VMXi vid Diamond Light Source
Beamline VMXi (hädanefter kallat “strålröret”) är ett unikt och nyutvecklat instrument helt dedikerat till rumstempererad, högautomatiserad röntgenkristallografi med fokus på att mäta data från kristaller i lämpliga kristallisationsplattor. Strålröret erbjuder ett mikrofokus (10 x 10 μm), rosa stråle (bandpass på <5 × 10-2ΔE/E) med ett högt flöde på ~2 × 1013 fotoner/s (vid 16 KeV)7. Denna högflödesstråle, i kombination med en snabb detektor, möjliggör mycket hög genomströmning av prover och insamling av data från prover upp till 10 μm i storlek.
Kristallisationsplattor kommer in i strålröret genom att lagras i ett provlagringssystem och avbildas baserat på det schema som tillhandahålls av användaren när plattorna registreras med hjälp av ISPyB11-gränssnittet SynchWeb12. Vanligtvis rekommenderas användare att välja en Fibonacci-sekvens av tidpunkter för avbildning (0, 12, 24, 36, 60… 7 320 timmar från det att skylten matas in i systemet). Användaren informeras via e-post när en skylt har avbildats. Både bilder av synligt ljus och UV-ljus är tillgängliga för användare på begäran. Bilderna som tas av provlagringssystemet analyseras av en maskininlärningsalgoritm; Detta lokaliserar och definierar automatiskt intressanta platser för objekt som liknar kristaller och registrerar de intressanta platser som är redo för användaren att lägga till i en kö för datainsamling. Användare kan också manuellt klicka på bilderna i synligt ljus för att registrera intressanta platser eller klicka och dra ett område som ska analyseras med rasterskanning. Dessa poäng är tillgängliga för användare att lägga till i kön tillsammans med de automatiskt placerade punkterna.
När alla prover har lämpliga parametrar för datainsamling går plattan in i en kö. När plattan når toppen av kön matas den automatiskt ut till strålröret. Kristallisationsplattorna laddas automatiskt från kristallhotellen till strålröret av en robotarm, och efter bildmatchning mäts kristallografiska datamängder med upp till 60° rotation från varje vald kristall enligt användardefinierade instruktioner. Alla droppar i en platta kan användas för dessa experiment på strålröret. Data slås samman från flera kristaller för att producera isomorfa, optimalt sammanslagna datamängder på ett automatiserat sätt 7,9. När alla köade datauppsättningar har samlats in får användaren ett e-postmeddelande med en länk att följa för att se datauppsättningarna i ISPyB11, liksom i andra Diamond MX-strålrör. Användare hänvisas också till strålröret web sida (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).
Vi har beskrivit hela proceduren från ankomsten av ett proteinprov i CF till nedladdning av de slutliga data av användaren för vidare applikationer. Kritiska steg är produktion av ett högkvalitativt proteinprov och lämpliga kristallskärmar, antingen med hjälp av kommersiella glesa matrisskärmar eller optimeringsskärmar baserade på etablerade förhållanden. Denna process kan äga rum i CF, eller så kan användare utföra kristallisationsprocedurerna i hemlaboratorierna och ta med lämpliga kristallisationsplattor till strålröret. Det kan vara viktigt att identifiera lämpliga parametrar för datainsamling för vissa prover, särskilt när det gäller strålningsskador. I de flesta fall är automatiserad databehandling fullt tillräcklig för att besvara den vetenskapliga frågan, även om användarna behåller möjligheten att bearbeta med hjälp av strålrörsverktygen, till exempel när rymdgruppen är tvetydig eller endast den första delen av de insamlade uppgifterna används för att minimera strålningsskadorna.
Om lämpliga kristaller inte produceras från initiala kristallisationsförsök, kan förändringar i proteinkoncentration, renhet eller kristallisationsskärmar undersökas, liksom användningen av kristallsådd. Om kristaller inte diffrakterar till en användbar upplösning vid strålröret, kan rutnätsskanningar användas med en odämpad stråle för att bedöma kristallernas inneboende diffraktionsgräns och enhetscell för att vägleda optimeringsinsatser. Kristaller som är för små för datainsamling i plattor (t.ex. <10 μm) kan istället vara lämpliga för seriell kristallografi eller nanofokusexperiment (t.ex. vid diamantstrålröret VMXm). Att lösa strukturer med hjälp av VMXi-data är i allmänhet enkelt genom molekylär ersättning, särskilt sedan tillkomsten av Alphafold16 för att ge effektiva sökmodeller. Om detta inte lyckas kan kristaller skördas och kryokylas från plattor för att möjliggöra konventionella envåglängdsavvikande diffraktion, flervåglängds anomal diffraktion eller fasningsexperiment med långa våglängder.
Fördelarna med denna metod inkluderar möjligheten att få snabba, högkvalitativa dataset och återkoppling direkt från kristallisationsplattor utan att behöva störa kristaller från de miljöer där de har vuxit. Den så kallade “rumstemperaturrenässansen” inom strukturbiologi premierar strukturer som erhålls under icke-kryogena förhållanden för att möjliggöra mer fysiologisk relevans och proteindynamikatt utforskas. Vanligtvis uppnås en något lägre upplösning än för en optimerad kryokyld kristall men endast när lämpliga kryoförhållanden har etablerats och om kristallerna är robusta för mekanisk hantering och öppning av kristallisationsdroppe3. En kommande applikation för vilken denna pipeline är mycket väl lämpad är en storskalig screening av protein-ligandkomplex eller fragmentkampanjer vid rumstemperatur inom läkemedelsutveckling. Ligander eller fragment kan antingen samkristalliseras eller tillsättas genom pipett eller akustisk dropputkastning före insamling av rumstemperaturdata. En annan tillämpning är att snabbt mäta data från många hundra eller tusentals kristaller på ett mycket effektivt sätt och sedan använda programvaran DIALS17 multiplex14 för att extrahera isomorfa kluster som kan representera olika biologiska enheter eller för att fastställa statistiskt signifikanta skillnader mellan populationer av kristaller som har behandlats på ett annat sätt eller exponerats för olika ligander eller signaler.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner de många Diamond Light Source-forskare och supportteammedlemmar som bidrog till designen, konstruktionen och driften av VMXi-strålröret. Vi är tacksamma för strålrörsanvändare, som senare har bidragit med idéer till utvecklingen av kristallisations- och datainsamlingspipelines. Kristallisationsanläggningen vid Harwell stöds av Diamond Light Source Ltd, Rosalind Franklin Institute och Medical Research Council.
Formulator | Formulatrix | on request | Liquid handling robot |
Formulatrix imager | Formulatrix | on request | Crystallisation plate imager |
Greiner CrystalQuick X | Greiner | Z617644 | Crystallisation plate |
Gryphon | Art Robbins Instruments | 620-1000-10 | Crystalisation robot |
MiTeGen Insitu-1 | Mitegen | InSitu-01CL-40 | Crystallisation plate |
Mosquito LCP | (SPT Labtech) | on request | Crystallisation robot |
Rock Imager & Maker | Formualtrix | on request |
Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ |
Scorpion | Art Robbins Instruments | 640-1000-10 |
Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion |