Wir präsentieren ein Protokoll für die Kristallisation von Proteinen unter Verwendung der Kristallisationsanlage im Forschungskomplex in Harwell und die anschließende in-situ-Röntgenkristallographie-Datenerfassung von Kristallen innerhalb der Platten an der Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) Beamline von Diamond. Wir beschreiben Probenanforderungen, Kristallisationsprotokolle und Richtlinien für die Datenerfassung.
Es werden Protokolle für die robotergestützte Proteinkristallisation mit der Crystallization Facility in Harwell und die In-situ-Datenerfassung bei Raumtemperatur von Kristallisationsplatten an der Diamond Light Source-Beamline VMXi beschrieben. Dieser Ansatz ermöglicht es, qualitativ hochwertige Kristallstrukturen bei Raumtemperatur aus mehreren Kristallen auf einfache Weise zu bestimmen und liefert eine sehr schnelle Rückmeldung über die Ergebnisse von Kristallisationsversuchen sowie eine serielle Kristallographie. Der Wert von Strukturen bei Raumtemperatur für das Verständnis der Proteinstruktur, Ligandenbindung und -dynamik wird in der Strukturbiologie zunehmend anerkannt. Diese Pipeline ist für Benutzer aus der ganzen Welt mit mehreren verfügbaren Zugriffsmodi zugänglich. Aufgebaute Kristallisationsexperimente können abgebildet und aus der Ferne betrachtet werden, wobei Kristalle mithilfe eines maschinellen Lerntools automatisch identifiziert werden. Die Daten werden in einem warteschlangenbasierten System mit bis zu 60°-Rotationsdatensätzen aus benutzerdefinierten Kristallen in einer Platte gemessen. Die Daten aller Kristalle innerhalb einer bestimmten Vertiefung oder Probengruppe werden automatisch mit xia2.multiplex zusammengeführt, wobei die Ausgaben direkt über eine Webbrowser-Schnittstelle abgerufen werden können.
Die Röntgenkristallographie ist nach wie vor ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis der Struktur und Funktion von Proteinen, da sie hochauflösende Strukturen von Proteinen oder deren Komplexen liefert, z. B. mit Substraten oder Wirkstoffkandidaten. In vielen Fällen bleibt jedoch die Gewinnung von Kristallen mit wünschenswerten Eigenschaften – stark beugend, Kristallform, die für das Einweichen geeignet ist und ohne Kristallpathologien wie Zwillinge – ein erheblicherEngpass 1. Da geeignete chemische Bedingungen zur Herstellung von Proteinkristallen im Allgemeinen nicht vorhergesagt werden können, ist das Kristallisations-Screening, bei dem Tausende potenzieller chemischer Mischungen untersucht werden, Standard, oft unterstützt durch Automatisierung/Robotik bei der Einstellung von Bildschirmen und Kristallhotels zur Überwachung der aufgezeichneten Kristallisationstropfenbilder, oft aus der Ferne.
Wenn Kristalle auftreten, müssen sie in der Regel mit einer Nylon- oder Kaptonschleife aus der Kristallisationsumgebung geerntet und dann in ein Tröpfchen überführt werden, das ein Kryoschutzmittel enthält (dessen Suche eine zusätzliche Variable ist), bevor sie in flüssigen Stickstoff gefriert werden. Diese zusätzlichen Schritte zwischen der Kristallisation und der Röntgendatenerfassung können unter anderem eine Dehydrierung des Kristallisationstropfens beinhalten, wenn seine versiegelte Umgebung gebrochen wird, mechanische Belastungen des Kristalls bei der Handhabung und eine Beschädigung des Kristallgitters durch die Kryoschutzmittel (was typischerweise zu einer erhöhten Mosaikausbreitung führt)2. Darüber hinaus ist die Kristallernte zeit- und arbeitsintensiv und kann zu Inhomogenitäten zwischen den Proben führen, insbesondere wenn sich während des Ernteprozesses Haut auf Tropfen bildet. Die VMXi-Beamline ermöglicht den Zugriff auf nutzbare Daten von Kristallen, die auf der Platte kleben und sonst für die Datenerfassung verworfen würden.
Die überwiegende Mehrheit der Röntgenkristallstrukturen wird mit dem oben genannten Ansatz bei 100 K bestimmt, was einen einfachen Kristalltransport und eine einfache Handhabung ermöglicht und die Lebensdauer der Kristalle im Röntgenstrahl um Größenordnungen erhöht. Es besteht jedoch ein zunehmendes Interesse an der Bestimmung von Strukturen unter nicht-kryogenen Bedingungen, d.h. viel näher an den physiologischen Bedingungen, die für die Proteinfunktion relevant sind 2,3,4. Dies ermöglicht ein viel besseres Verständnis der dynamischen Struktur von Proteinen, vermeidet, dass Aminosäurekonformationen oder Schleifen in funktionell nicht relevanten Zuständen eingefroren werden5, und ermöglicht es, die Ligandenbindung unter Bedingungen zu untersuchen, die denen in der natürlichen Umgebung des Proteins innerhalb der Zelle und des Organismus viel näher kommen6.
Ein alternativer Ansatz, der an der Beamline Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) am Synchrotron Diamond Light Source, Großbritannien, implementiert wurde, besteht darin, die Beugungsdaten direkt von Kristallen in der Umgebung, in der sie gewachsen sind (d. h. innerhalb der Kristallisationsplatte), unter Umgebungsbedingungen und ohne Störung zu messen 7,8. Dies ermöglicht eine sehr schnelle Rückmeldung von Kristallisationsbildschirmen und Optimierungen, um den Anwender zu einer optimalen Kristallform für seine Anforderungen zu führen. Sie ermöglicht auch die automatisierte Herstellung hochwertiger Strukturen bei Raumtemperatur9.
Dieses Protokoll geht davon aus, dass ein Benutzer eine hochreine Proteinprobe zur Kristallisation bereitsteht. Wir beschreiben die Benutzererfahrung beim Zugriff auf die Kristallisationsanlage in Harwell, um Proteinkristalle herzustellen und dann die Beamline VMXi für die Datenerfassung zu verwenden (Abbildung 1).
Die Kristallisationsanlage in Harwell
Die Kristallisationsanlage in Harwell (CF) befindet sich im Forschungskomplex in Harwell (RCaH) neben der Diamond Light Source. Die Anlage bietet Anwendern ein automatisiertes Hochdurchsatzlabor für makromolekulare Kristallisation, das Robotik für das Kristallisationsscreening, die Kristalloptimierung, die Kristallbildgebung und die Charakterisierung einsetzt. Durch die enge Integration mit der hochautomatisierten VMXi-Beamline hat sich das Tempo bei der Bestimmung von Strukturen bei Raumtemperatur stark beschleunigt und ermöglicht die Charakterisierung neuartiger Proteinstrukturen, Protein-Ligand- und DNA-Liganden-Komplexe sowie ein automatisiertes Fragment-Screening (Abbildung 1) unter nicht-kryogenen Bedingungen.
Die CF-Pipeline besteht aus einer Reihe von Instrumenten, die Nanoliter-Kristallisationsroboter9 für die Kristallisation von löslichen Proteinen und Membranproteinen, Liquid-Handling-Roboter zur Herstellung kommerzieller Kristallisationssiebe und komplexer kundenspezifischer Optimierungsbildschirme sowie vier Bildgebungsinstrumente (eines bei 4 °C und drei bei 20 °C für die Abbildung von Kristallisationsplatten (siehe Materialtabelle) umfassen). Ein Imager ist in der Lage, Lipid-Cubic-Phase-Glasplatten (LCP) abzubilden, und ein Imager ist mit einer Multifluoreszenzoptik ausgestattet (beide bei 20 °C).
Die Anlage wird heute von einem breiten Spektrum akademischer und industrieller Nutzer genutzt, darunter das Membrane Protein Laboratory (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), die XChem Fragment Screening Facility 10, MX Beamlines, der XFEL-Hub sowie das Rosalind Franklin Institute (RFI). Diese gut etablierte und optimierte Pipeline hat es ermöglicht, Kristallisationsexperimente in einem breiten Spektrum von strukturbiologischen Projekten durchzuführen. Dieses Dokument beschreibt die Pipeline für Kristalle, die für die Datenerfassung bei VMXi bestimmt sind, obwohl Kristalle auch geerntet und kryogekühlt oder an die XChem-Pipeline geleitet werden können.
Der Benutzerzugang wird über das Diamond MX Proposal System (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) zugewiesen und industrielle Benutzer werden durch die Diamond Industry Liaison Group unterstützt. Alle Benutzer können mit ihrer Probe(n) oder Platten, die von Hand transportiert werden können, auf die Baustelle kommen. Es wird nicht empfohlen, Platten per Kurier zu versenden, da sich die Tropfen erfahrungsgemäß von der Stelle, an der sie ausgegeben wurden, entfernen oder durch das Kristallisationsreservoir beschädigt werden können. Alternativ können Anwender ihre Proteinproben nach Absprache an die CF schicken, wo Mitarbeiter in ihrem Auftrag Kristallisationsexperimente durchführen. Die Experimente können vom Benutzer aus der Ferne überwacht werden, indem er sich im Falle von CF entweder bei Rock Maker Web oder im Falle von VMXi über ISPyB anmeldet. Der Zugang zur Mukoviszidose kann iterativ auf der Grundlage der bei Diamond gesammelten Röntgenbeugungsergebnisse erfolgen.
Beamline VMXi an Diamantlichtquelle
Die Beamline VMXi (im Folgenden als “Beamline” bezeichnet) ist ein einzigartiges und kürzlich entwickeltes Instrument, das vollständig für die hochautomatisierte Röntgenkristallographie bei Raumtemperatur bestimmt ist, wobei der Schwerpunkt auf der Messung von Daten von Kristallen in geeigneten Kristallisationsplatten liegt. Die Beamline bietet einen Mikrofokus (10 x 10 μm), rosa Strahl (Bandpass von <5 × 10-2ΔE/E) mit einem hohen Fluss von ~2 × 1013 Photonen/s (bei 16 KeV)7. Dieser High-Flux-Strahl, gekoppelt mit einem schnellen Detektor, ermöglicht einen sehr hohen Durchsatz von Proben und die Erfassung von Daten von Proben mit einer Größe von mehr als 10 μm.
Kristallisationsplatten gelangen in die Beamline, indem sie in einem Probenspeichersystem gespeichert und auf der Grundlage des Zeitplans abgebildet werden, den der Benutzer bei der Registrierung der Platten über die ISPyB11-Schnittstelle SynchWeb12 angegeben hat. In der Regel wird dem Benutzer empfohlen, eine Fibonacci-Folge von Zeitpunkten für die Bildgebung auszuwählen (0, 12, 24, 36, 60… 7.320 h ab Eingabe der Platte in das System). Der Benutzer wird per E-Mail informiert, sobald eine Platte belichtet wurde. Sowohl die Bildgebung mit sichtbarem Licht als auch mit UV-Licht steht den Anwendern auf Anfrage zur Verfügung. Die vom Probenspeichersystem aufgenommenen Bilder werden von einem Algorithmus für maschinelles Lernen analysiert. Dadurch werden automatisch Points of Interest von Objekten, die Kristallen ähneln, lokalisiert und definiert, und die Points of Interest werden registriert, damit der Benutzer sie einer Warteschlange für die Datenerfassung hinzufügen kann. Benutzer können auch manuell auf die Bilder des sichtbaren Lichts klicken, um Points of Interest zu registrieren, oder sie können auf eine Region klicken und ziehen, die per Raster-Scan analysiert werden soll. Diese Punkte stehen den Benutzern zur Verfügung, um sie der Warteschlange zusammen mit den automatisch gefundenen Punkten hinzuzufügen.
Sobald alle Proben die entsprechenden Parameter für die Datenerfassung aufweisen, kommt die Platte in eine Warteschlange. Wenn die Platte die Spitze der Warteschlange erreicht, wird sie automatisch an die Beamline abgegeben. Die Kristallisationsplatten werden von einem Roboterarm automatisch von den Kristallhotels in die Beamline geladen, und nach dem Bildabgleich werden kristallographische Datensätze mit einer Drehung von bis zu 60° von jedem ausgewählten Kristall gemäß benutzerdefinierten Anweisungen gemessen. Alle Tropfen innerhalb einer Platte können für diese Experimente an der Beamline verwendet werden. Daten aus mehreren Kristallen werden automatisiert zusammengeführt, um isomorphe, optimal zusammengeführte Datensätze zu erzeugen 7,9. Sobald alle in der Warteschlange befindlichen Datensätze erfasst sind, erhält der Benutzer eine E-Mail mit einem Link, dem er folgen muss, um die Datensätze in ISPyB11 wie in anderen Diamond MX-Beamlines anzuzeigen. Die Nutzer werden auch auf die Beamline-Webseite (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html) weitergeleitet.
Wir haben den gesamten Ablauf von der Ankunft einer Proteinprobe in der Mukoviszidose bis zum Herunterladen der finalen Daten durch den Anwender für weitere Anwendungen beschrieben. Kritische Schritte sind die Herstellung einer qualitativ hochwertigen Proteinprobe und geeigneter Kristallsiebe, entweder unter Verwendung kommerzieller dünnbesetzter Matrixsiebe oder Optimierungssiebungen auf der Grundlage etablierter Bedingungen. Dieser Prozess kann im CF stattfinden, oder Anwender können die Kristallisationsvorgänge in den Heimlaboren durchführen und geeignete Kristallisationsplatten an die Beamline bringen. Die Identifizierung geeigneter Datenerfassungsparameter kann für bestimmte Proben wichtig sein, insbesondere wenn Strahlenschäden ein Problem darstellen. In den meisten Fällen ist die automatisierte Datenverarbeitung völlig ausreichend, um die wissenschaftliche Fragestellung zu beantworten, obwohl die Benutzer weiterhin die Möglichkeit haben, mit den Beamline-Werkzeugen nachzuverarbeiten, z. B. wenn die Raumgruppe mehrdeutig ist oder nur der erste Teil der gesammelten Daten verwendet wird, um die Auswirkungen von Strahlenschäden zu minimieren.
Wenn aus anfänglichen Kristallisationsversuchen keine geeigneten Kristalle hergestellt werden, können Änderungen der Proteinkonzentration, der Reinheit oder der Kristallisationssiebe untersucht werden, ebenso wie die Verwendung von Kristallimpfungen. Wenn Kristalle an der Beamline nicht auf eine brauchbare Auflösung gebeugt werden, können Gitterscans mit einem nicht abgeschwächten Strahl verwendet werden, um die inhärente Beugungsgrenze und die Elementarzelle der Kristalle zu beurteilen und die Optimierungsbemühungen zu steuern. Kristalle, die für die Datenerfassung innerhalb von Platten zu klein sind (z. B. <10 μm), können stattdessen für serielle Kristallographie oder Nanofokusexperimente (z. B. an der Diamant-Beamline VMXm) geeignet sein. Das Lösen von Strukturen unter Verwendung von VMXi-Daten ist im Allgemeinen einfach durch molekularen Ersatz, insbesondere seit dem Aufkommen von Alphafold16 , um effektive Suchmodelle zu erhalten. Wenn dies nicht erfolgreich ist, können Kristalle geerntet und von Platten kryogekühlt werden, um konventionelle Experimente mit anomaler Beugung einzelner Wellenlängen, anomaler Beugung mit mehreren Wellenlängen oder Experimenten mit langen Wellenlängenphasen zu ermöglichen.
Zu den Vorteilen dieser Methode gehört die Möglichkeit, schnelle, qualitativ hochwertige Datensätze und Rückmeldungen direkt von Kristallisationsplatten zu erhalten, ohne dass Kristalle aus den Umgebungen, in denen sie gewachsen sind, gestört werden müssen. Die sogenannte “Raumtemperatur-Renaissance” in der Strukturbiologie legt Wert auf Strukturen, die unter nicht-kryogenen Bedingungen gewonnen wurden, um mehr physiologische Relevanz und Proteindynamik zu erforschen2. In der Regel wird eine etwas geringere Auflösung als bei einem optimierten kryogekühlten Kristall erreicht, jedoch nur, wenn geeignete Kryobedingungen hergestellt wurden und wenn die Kristalle robust gegenüber mechanischer Handhabung und Öffnung des Kristallisationstropfens3 sind. Eine bevorstehende Anwendung, für die sich diese Pipeline sehr gut eignet, ist ein großflächiges Screening von Protein-Liganden-Komplexen oder Fragmentkampagnen bei Raumtemperatur in der Wirkstoffforschung. Liganden oder Fragmente können entweder kokristallisiert oder durch Pipette oder akustisches Tropfenauswerfen vor der Datenerfassung bei Raumtemperatur hinzugefügt werden. Eine weitere Anwendung besteht darin, Daten von vielen Hunderten oder Tausenden von Kristallen schnell auf hocheffiziente Weise zu messen und dann die Software DIALS17 Multiplex14 zu verwenden, um isomorphe Cluster zu extrahieren, die verschiedene biologische Einheiten darstellen können, oder um statistisch signifikante Unterschiede zwischen Populationen von Kristallen festzustellen, die auf unterschiedliche Weise behandelt oder anderen Liganden oder Signalen ausgesetzt wurden.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den vielen Wissenschaftlern der Diamond Light Source und den Mitgliedern des Support-Teams, die zur Planung, zum Bau und zum Betrieb der VMXi-Beamline beigetragen haben. Wir danken den Beamline-Nutzern, die später Ideen zur Entwicklung der Kristallisations- und Datensammelpipelines beigetragen haben. Die Kristallisationsanlage in Harwell wird von Diamond Light Source Ltd., dem Rosalind Franklin Institute und dem Medical Research Council unterstützt.
Formulator | Formulatrix | on request | Liquid handling robot |
Formulatrix imager | Formulatrix | on request | Crystallisation plate imager |
Greiner CrystalQuick X | Greiner | Z617644 | Crystallisation plate |
Gryphon | Art Robbins Instruments | 620-1000-10 | Crystalisation robot |
MiTeGen Insitu-1 | Mitegen | InSitu-01CL-40 | Crystallisation plate |
Mosquito LCP | (SPT Labtech) | on request | Crystallisation robot |
Rock Imager & Maker | Formualtrix | on request |
Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ |
Scorpion | Art Robbins Instruments | 640-1000-10 |
Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion |