Summary

Echtzeit-Bildgebung der akrosomalen Kalziumdynamik und Exozytose in lebenden Mäusespermien

Published: October 13, 2023
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Summary

Das hier beschriebene AcroSensE-Mausmodell und die hier beschriebenen Live-Cell-Imaging-Methoden bieten einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Kalziumdynamik im subzellulären Kompartiment des Spermienakrosoms und wie sie Zwischenschritte regulieren, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.

Abstract

Die Akrosom-Exozytose (AE), bei der das einzelne exozytotische Vesikel der Spermien mit der Plasmamembran verschmilzt, ist ein komplexer, kalziumabhängiger Prozess, der für die Befruchtung unerlässlich ist. Unser Verständnis darüber, wie die Kalziumsignalisierung die AE reguliert, ist jedoch noch unvollständig. Insbesondere das Zusammenspiel zwischen intraakrosomaler Kalziumdynamik und den Zwischenschritten, die zur AE führen, ist nicht gut definiert. Hier beschreiben wir eine Methode, die räumliche und zeitliche Einblicke in die akrosomale Kalziumdynamik und deren Beziehung zur Membranfusion und anschließenden Exozytose des Akrosomvesikels liefert. Die Methode verwendet eine neuartige transgene Maus, die einen Akrosomen-gerichteten Sensor für Exozytose (AcroSensE) exprimiert. Der Sensor kombiniert einen genetisch kodierten Kalziumindikator (GCaMP), der mit mCherry fusioniert ist. Dieses Fusionsprotein wurde speziell entwickelt, um die gleichzeitige Beobachtung von akrosomaler Kalziumdynamik und Membranfusionsereignissen zu ermöglichen. Die Echtzeitüberwachung der akrosomalen Kalziumdynamik und AE in lebenden AcroSensE-Spermien wird durch eine Kombination aus Bildgebung mit hoher Bildrate und einem Stimulanzien-Verabreichungssystem erreicht, das auf einzelne Spermien abzielen kann. Dieses Protokoll enthält auch mehrere Beispiele für grundlegende Methoden zur Quantifizierung und Analyse der Rohdaten. Da das AcroSensE-Modell genetisch kodiert ist, kann seine wissenschaftliche Bedeutung durch die Verwendung leicht verfügbarer genetischer Werkzeuge wie Kreuzungen mit anderen genetischen Modellen der Maus oder auf der Genom-Editierung (CRISPR) basierende Methoden erhöht werden. Mit dieser Strategie können die Rollen zusätzlicher Signalwege bei der Spermienkapazität und -befruchtung aufgeklärt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode ein bequemes und effektives Werkzeug darstellt, um die Kalziumdynamik in einem bestimmten subzellulären Kompartiment – dem Spermienakrosom – zu untersuchen und wie diese Dynamik die Zwischenschritte reguliert, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.

Introduction

Spermien erwerben die Fähigkeit zur Befruchtung während eines Prozesses, der als Kapazitation1 bezeichnet wird. Ein Endpunkt dieses Prozesses ist, dass die Spermien die Fähigkeit erwerben, AE zu durchlaufen. Daten aus mehr als zwei Jahrzehnten belegen das Vorhandensein eines komplexen, mehrstufigen Modells der AE in Säugetierspermien (zusammengefasst in 2,3). Die Untersuchung von AE in lebenden Spermien ist jedoch eine Herausforderung, und die derzeit verfügbaren Methoden zur Überwachung dieses Prozesses mit ausreichender Auflösung sind umständlich und erfordern mehrere Präparationsschritte4, beschränken sich auf den Nachweis des letzten Schritts der AE (z. B. unter Verwendung von PNA5), beschränken sich auf Messungen von Veränderungen des zytosolischen Kalziums (im Gegensatz zur akrosomalen Kalziumdynamik), oder beschränken sich auf Messungen der zytosolischen Kalziumdynamik oder der AE6.

Um einige der wichtigsten Einschränkungen von Echtzeit-AE-Studien unter physiologischen Bedingungen zu überwinden und die Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Kalziumdynamik und AE zu ermöglichen, wurde ein einzigartiges Mausmodell generiert. In diesem Mausmodell wird ein Fusionsprotein, das aus dem genetisch kodierten Ca2+-Sensor (GCaMP3) und mCherry besteht, exprimiert und mit Hilfe eines Acrosin-Promotors und eines Signalpeptids2 auf das Akrosom ausgerichtet. Der gezielte duale GCaMP3-mCherry-Sensor ermöglicht die gleichzeitige Echtzeitmessung der Kalziumkonzentration und des Status des akrosomalen Inhalts in lebenden Spermien unter physiologischen Bedingungen unter Verwendung von Mikroskopie und einem Einzelzell-Stimulanzien-Verabreichungssystem (Abbildung 1). Als Bestandteil der akrosomalen Matrix würden Membranfusion und AE zum Verlust der photostabilen und pH-unempfindlichen mCherry-Fluoreszenz aus den Spermien führen, da dieses Protein aus dem Akrosomvesikel diffundiert. In dieser Hinsicht ist die Fähigkeit des Modells, den Zeitpunkt und das Auftreten von AE zu reflektieren, vergleichbar mit den Vorteilen der Akrosom-gerichteten GFP-Mauslinie 7,8,9.

Die in dieser transgenen Mauslinie verwendete GCaMP3-Variante hat eine ungefähre KD von 400 μM und einen Dynamikbereich für Ca2+ von 10-4-10-3 M10, der für dieses Vesikel geeignet ist. Wir konnten zeigen, dass diese Kombination von Eigenschaften von GCaMP3 die Bildung von Fusionsporen zwischen der Plasmamembran und der äußeren akrosomalen Membran (OAM) aufdecken kann2. Die Fusionsporendetektion ist darauf zurückzuführen, dass die Porengröße zu klein ist, um es dem AcroSensE-Protein zu ermöglichen, sich aus dem Akrosom zu dispergieren (durch Verlust des Akrosomgehalts), während gleichzeitig ein Membran-“Kanal” bereitgestellt wird, der den Einstrom von Ca2+-Ionen in das Akrosomlumen ermöglicht, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität des GCaMP3 führt.

Das helle, monomere, nicht-kalziumempfindliche fluoreszierende Protein mCherry unterstützt die Visualisierung des Akrosoms, während das GCaMP3-Signal schwach ist (z. B. vor der Ca2+ -Bindung, Abbildung 2), und ermöglicht vor allem auch die Identifizierung von Akrosom-intakten Samenzellen, die für die Bildgebung geeignet sind.

Das folgende Protokoll beschreibt die Verwendung des einzigartigen AcroSensE-Mausmodells und der Methoden für die Mikroskopie, die experimentell verwendet werden, um die Kalziumdynamik von AE und Spermien mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen.

Protocol

Alle Tierbehandlungen wurden gemäß den Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Cornell University genehmigt (#2002-0095). Für die vorliegende Studie wurden 8-10 Wochen alte AcroSensE-Mäuse2 verwendet. Anfragen zur Verfügbarkeit der AcroSensE-Mäuse können an den korrespondierenden Autor gerichtet werden. 1. Samenentnahme und -wäsche Entnahme von Cauda-Nebenhodenspermien (weitere Details zu diese…

Representative Results

Abbildung 2 zeigt eine vereinfachte Darstellung, die die Abfolge der Fluoreszenzänderungen zeigt, die nach der erfolgreichen Stimulation der Spermien zu erwarten sind. Das obere Feld von Abbildung 2 zeigt die Änderungen der GCaMP3-Fluoreszenzintensität, bei der das Signal zunächst schwach ist (die akrosomalen Kalziumkonzentrationen sind niedriger als die GCaMP3-KD) und beim Eintritt von Kalziumionen über Fusionsporen die Helligkeit der Fluoreszenz …

Discussion

Hier wird eine mikroskopiebasierte Methode beschrieben, um das neu generierte AcroSensE-Mausmodell für die Echtzeit-Einzelzellüberwachung und -analyse des Zusammenspiels zwischen akrosomaler Kalziumdynamik und Zwischenschritten, die zu AE führen, zu nutzen. Zusammen mit leicht verfügbaren genetischen Ansätzen, wie z. B. der Kreuzung mit anderen genetischen Modellen der Maus oder der Geneditierung, bieten dieses Modell und diese Methode ein leistungsfähiges System, um die Rolle verschiedener Komponenten und Signalwe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants R01-HD093827 und R03-HD090304 (A.J.T.) unterstützt.

Materials

100x oil objective  Olympus Japan UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin  Sigma C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness MatTek Corp.  P35G-1.5-20-C 
5 mL round-bottomed tube Falcon 352054
Borosilicate glass capilarries Sutter Instrument Co. CA USA B200-156-10
CaCl2 Sigma C4901
Confocal microscope Olympus Japan Olympus FluoView 
Glucose  Sigma G7528
Graduated tip  TipOne, USA Scientific
HEPES Sigma H7006
ImageJ  National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl Sigma P9541
Lactic acid Sigma G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems  TOKAI HIT Shizuoka, Japan Model STX
MgCl2 Sigma M8266
Micropipette Puller  Sutter Instrument Co. CA USA Model P-97
NaCl Sigma S3014
NaHCO3 Sigma S6297
Plastic transfer pipette  FisherBrand  13-711-6M
Poly-D-lysine  Sigma P7280
Pyruvic acid Sigma 107360
Single cell delivery system Parker, Hauppauge, NY Picospritzer III

References

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Cite This Article
Cohen, R., Sosnicki, D. M., White, M. A., Nelson, J. L., Mukai, C., Travis, A. J. Real-Time Imaging of Acrosomal Calcium Dynamics and Exocytosis in Live Mouse Sperm. J. Vis. Exp. (200), e65962, doi:10.3791/65962 (2023).

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