التصوير في الوقت الحقيقي لديناميات الكالسيوم الأكروسومي والإخراج الخلوي في المنوية للفأر الحي
Summary
يوفر نموذج الفأر AcroSensE وطرق تصوير الخلايا الحية الموصوفة هنا نهجا جديدا لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في المقصورة تحت الخلوية للحيوانات المنوية القمية وكيفية تنظيمها للخطوات الوسيطة التي تؤدي إلى اندماج الغشاء وكثرة الخلايا القمي.
Abstract
الإخراج الخلوي القمي (AE) ، حيث تندمج الحويصلة الخارجية المفردة للحيوانات المنوية مع غشاء البلازما ، هي عملية معقدة تعتمد على الكالسيوم ضرورية للتخصيب. ومع ذلك ، فإن فهمنا لكيفية تنظيم إشارات الكالسيوم AE لا يزال غير مكتمل. على وجه الخصوص ، التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم داخل الأكروسوم والخطوات الوسيطة المؤدية إلى AE غير محدد جيدا. هنا ، نصف طريقة توفر رؤى مكانية وزمانية لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية وعلاقتها باندماج الغشاء والإخراج الخلوي اللاحق للحويصلة القمي. تستخدم الطريقة فأرا جديدا معدلا وراثيا يعبر عن مستشعر يستهدف Acrosome للإخراج الخلوي (AcroSensE). يجمع المستشعر بين مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GCaMP) المنصهر مع mCherry. تم تصميم بروتين الاندماج هذا خصيصا لتمكين المراقبة المتزامنة لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية وأحداث اندماج الغشاء. يتم تحقيق المراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية و AE في المنوية الحية AcroSensE باستخدام مزيج من التصوير بمعدل إطارات مرتفع ونظام توصيل المنشطات الذي يمكن أن يستهدف المنوية المفردة. يوفر هذا البروتوكول أيضا العديد من الأمثلة على الطرق الأساسية لتحديد وتحليل البيانات الأولية. نظرا لأن نموذج AcroSensE مشفر وراثيا ، يمكن زيادة أهميته العلمية باستخدام الأدوات الجينية المتاحة بسهولة ، مثل التهجين مع النماذج الجينية الأخرى للفئران أو الأساليب القائمة على تحرير الجينات (CRISPR). باستخدام هذه الاستراتيجية ، يمكن حل أدوار مسارات الإشارات الإضافية في سعة المنوية والإخصاب. باختصار ، توفر الطريقة الموضحة هنا أداة ملائمة وفعالة لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في حجرة تحت خلوية محددة – الجسيم القمي للحيوانات المنوية – وكيف تنظم هذه الديناميات الخطوات الوسيطة التي تؤدي إلى اندماج الغشاء وكثرة الخلايا القمي.
Introduction
تكتسب المنوية القدرة على الإخصاب أثناء عملية تسمى السعة1. إحدى نقاط النهاية لهذه العملية هي أن المنوية تكتسب القدرة على الخضوع ل AE. أكثر من عقدين من البيانات تدعم وجود نموذج معقد متعدد الخطوات من AE في المنوية للثدييات (ملخصة في2،3). ومع ذلك ، فإن دراسة AE في المنوية الحية أمر صعب ، والطرق المتاحة حاليا لمراقبة هذه العملية بدقة كافية مرهقة وتتطلب خطوات تحضير متعددة4 ، وتقتصر على اكتشاف الخطوة الأخيرة من AE (على سبيل المثال ، باستخدام PNA5) ، تقتصر على قياسات التغيرات في الكالسيوم الخلوي (على عكس ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومي) ، أو تقتصر على قياسات ديناميات الكالسيوم الخلوية أو AE6.
للتغلب على بعض القيود الرئيسية لدراسات AE في الوقت الفعلي في ظل الظروف الفسيولوجية ولتمكين التحقيق في التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم و AE ، تم إنشاء نموذج فأر فريد. في نموذج الفأر هذا ، يتم التعبير عن بروتين اندماج يتكون من مستشعر Ca2+ المشفر وراثيا (GCaMP3) و mCherry واستهدافه إلى الجسيم القمي باستخدام محفز أكروسين وببتيد إشارة2. يتيح مستشعر GCaMP3-mCherry المزدوج المستهدف إجراء قياسات متزامنة في الوقت الفعلي لتركيزات الكالسيوم وحالة المحتويات القحمية في المنوية الحية في ظل الظروف الفسيولوجية باستخدام الفحص المجهري ونظام توصيل المنشطات أحادي الخلية (الشكل 1). كمكون من مكونات المصفوفة القمي، فإن الاندماج الغشائي و AE سيؤدي إلى فقدان مضان mCherry القابل للضوء وغير الحساس للأس الهيدروجيني من المنوية؛ حيث ينتشر هذا البروتين خارج حويصلة الجسيم القمي. في هذا الصدد ، فإن قدرة النموذج على عكس توقيت وحدوث AE تشبه فوائد خط الماوس GFP المستهدفللجسيم القمي 7،8،9.
يحتوي متغير GCaMP3 المستخدم في خط الماوس المعدل وراثيا هذا على دينار كويتي تقريبي يبلغ 400 ميكرومتر ونطاق ديناميكي ل Ca2+ من 10-4-10-3 M10 ، وهو مناسب لهذه الحويصلة. لقد أظهرنا أن هذا المزيج من ميزات GCaMP3 يمكن أن يكشف عن تكوين مسام الاندماج بين غشاء البلازما والغشاء الأكروسومي الخارجي (OAM) 2. إن اكتشاف مسام الاندماج هو نتيجة لكون حجم المسام صغيرا جدا بحيث لا يسمح لبروتين AcroSensE بالانتشار خارج الجسم القمي (عن طريق فقدان محتوى الجسيم القمي) مع توفير “قناة” غشائية تمكن من تدفق أيونات الكالسيوم2+ إلى تجويف الجسم القمي ، مما يؤدي إلى زيادة كثافة مضان GCaMP3.
يدعم البروتين الفلوري mCherry اللامع والأحادي وغير الحساس للكالسيوم تصور الجسيم القمي بينما تكون إشارة GCaMP3 باهتة (على سبيل المثال ، قبل ربط Ca2+ ، الشكل 2) ، والأهم من ذلك ، أنه يسمح أيضا بتحديد خلايا المنوية السليمة القمي المناسبة للتصوير.
يصف البروتوكول التالي استخدام نموذج الماوس AcroSensE الفريد وطرق الفحص المجهري المستخدمة تجريبيا لدراسة ديناميكيات الكالسيوم AE المنوية بدقة مكانية وزمانية عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم وصف طريقة قائمة على الفحص المجهري لاستخدام نموذج الماوس AcroSensE الذي تم إنشاؤه حديثا للمراقبة في الوقت الفعلي أحادي الخلية وتحليل التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية والخطوات الوسيطة المؤدية إلى AE. جنبا إلى جنب مع الأساليب الجينية المتاحة بسهولة ، مثل التهجين مع النماذج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01-HD093827 و R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
