טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי בתיווך כורכומינואיד על מודל מורין של קנדידאזיס פומי
Summary
פרוטוקול זה מתאר את היישום של טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) במודל מורין של קנדידה אוראלית. aPDT בוצע באמצעות תערובת מסיסה במים של כורכומינואידים ואור LED כחול.
Abstract
טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) נחקר בהרחבה במבחנה, ומודלים פרה-קליניים של זיהומים בבעלי חיים מתאימים להערכת טיפולים אלטרנטיביים לפני ניסויים קליניים. מחקר זה מתאר את היעילות של aPDT במודל מורין של קנדידה אוראלית. ארבעים עכברים עברו דיכוי חיסוני באמצעות זריקות תת-עוריות של פרדניזולון, ולשונם חוסנה באמצעות מטוש אוראלי שהושרה בעבר בתרחיף תאי C. albicans . טטרציקלין ניתן באמצעות מי שתייה במהלך הניסוי. חמישה ימים לאחר החיסון הפטרייתי, עכברים חולקו באופן אקראי לשמונה קבוצות; קבוצה תשיעית של עכברים לא נגועים שלא טופלו נכללה כקבוצת ביקורת שלילית (n = 5). שלושה ריכוזים (20 μM, 40 μM ו-80 μM) של תערובת כורכומינואידים נבדקו עם נורת LED כחולה (89.2 mW/cm2; ~455 nm) וללא אור (קבוצות C+L+ ו-C+L, בהתאמה). אור בלבד (C-L+), ללא טיפול (C-L-), ובעלי חיים ללא זיהום הוערכו כקבוצת ביקורת. הנתונים נותחו באמצעות מבחני ANOVA ו-Games-Howell של וולש (α = 0.05). קנדידה אוראלית הוקמה בכל בעלי החיים הנגועים ודמיינה באופן מקרוסקופי באמצעות נוכחות של כתמים לבנים אופייניים או pseudomembranes על גבי הלשונות. חלקים היסטופתולוגיים אישרו נוכחות גדולה של שמרים וחוטים המוגבלים לשכבה הקרטיניסטית של האפיתל בקבוצת C-L, ונוכחותם של תאים פטרייתיים הופחתה חזותית בתמונות שהתקבלו מעכברים שנחשפו ל- aPDT עם כורכומינואידים של 40 מיקרומטר או 80 מיקרומטר. aPDT בתיווך כורכומינואידים של 80 מיקרומטר קידם ירידה של 2.47 לוג10 בספירת מושבות בהשוואה לאלה בקבוצת C-L- (p = 0.008). כל הקבוצות האחרות לא הראו ירידה מובהקת סטטיסטית במספר המושבות, כולל קבוצות פוטונסיטייזר (C+L-) או אור בלבד (C-L+). aPDT בתיווך כורכומינואיד הפחית את העומס הפטרייתי מהלשונות של עכברים.
Introduction
קנדידה אוראלית (OC) היא הזיהום הפטרייתי העיקרי של חלל הפה; זה נגרם על ידי צמיחת יתר של קנדידה spp. גורמים מקדימים לOC כוללים תפקוד אנדוקריני, שימוש באנטיביוטיקה רחבת טווח, רדיותרפיה וכימותרפיה, חסרים תזונתיים, קסרוסטומיה (זרימת רוק נמוכה), שימוש בשיניים תותבות, היגיינה לקויה, ובמיוחד, דיכוי חיסוני1. מבין מיני הקנדידה , קנדידה אלביקנס היא הנפוצה והארסית ביותר; הוא נמצא כמין קומנסלי בגוף האדם וכפתוגן אופורטוניסטי. ל-C. albicans יש את היכולת לשנות את המורפולוגיה שלו משמרים קומנסליים (blastopores) לחוטים פתוגניים (hyphae ו-pseudohyphae)2. צורות נימה, במיוחד hyphae, יכול לפלוש אפיתל המארח על ידי אנדוציטוזה או חדירה פעילה, גרימת זיהום3. גורמי אלימות אחרים של C. albicans כוללים הידבקות, היווצרות ביופילם והפרשת אנזימים ורעלים ליפוליטיים והידרוליטיים, כגון ליפאזות, פוספוליפאזות, פרוטאינאזות וקנדידליזין4.
טיפולי OC כוללים שימוש בחומרים אנטי פטרייתיים, במיוחד פוליאנים ואזולים מקומיים (ניסטטין ומיקונזול)5. עם זאת, הם מראים יעילות רק לטווח קצר, והישנות היא תכופה. בנוסף, שימוש יתר של antifungals הוליד את הבעיה של התפתחות עמידות אנטי פטרייתית והתפשטות6. לכן, יש צורך בטיפולים אלטרנטיביים, כגון טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT), המשלב פוטו-נסיטייזר (PS) ואור באורך גל מתאים (זהה לזה של ספיגת PS) בנוכחות חמצן. PSS קשורים לתאים או נקלטים בהם, וכאשר הם מופעלים על ידי אור, הם מייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS) שהם רעילים לתאים רגישים7.
ב-aPDT, אחד הפוטונסיטייזרים (PSs) שבהם נעשה שימוש הוא כורכומין (CUR), תרכובת טבעית המופקת מקני השורש של צמח הכורכום (Curcuma longa L.). יש לכורכומין תכונות טיפוליות רבות, כולל יכולות אנטי דלקתיות, נוגדות חמצון, אנטי-סרטניות ונוגדות חיידקים 8,9. מחקר קודם מצא כי aPDT באמצעות CUR הפחית ביעילות C. albicans במודל murine של קנדידה אוראלית מבלי לגרום נזק לרקמות המארח10. CUR הוא הכורכומינואיד העיקרי המופק מכורכום, אבל גם פוליפנולים אחרים, כמו דמתוקסיכורכומין וביס-דמתוקסיכורכומין, נמצאים בצמח זה. aPDT בתיווך כורכומינואיד הדגים פעילות אנטיבקטריאלית נגד ביופילמים של סטפילוקוקוס זהוב שגודלו בצנתרים11. עם זאת, למיטב ידיעתנו, פעילותו האנטי פטרייתית נגד C. albicans עדיין אינה ברורה. לכן, במחקר זה, הערכנו aPDT בתיווך מלח כורכומינואיד כנגד C. albicans במודל מורין של OC.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. albicans נקשר לזיהומים בפה ובוושט אצל אנשים עם מצב של מדוכאי חיסון, סוכרת, שימוש ממושך באנטיביוטיקה והיגיינת פה לקויה 1,3. המחקר של מחלות זיהומיות בבני אדם דורש הן חקירות חוץ גופיות והן חקירות in vivo לפני שניתן יהיה לתכנן ניסויים קליניים בצורה בטוח?…
Acknowledgements
המחברים מודים על התמיכה הכספית של FAPESP (קרן המחקר של סאו פאולו, מספר תהליך FAPESP #2013/07276-1 (CePID CePOF) ו- 2008/00601-6. אנו מודים גם לד”ר אנה פאולה סילבה על אספקת המידע על מלח מסיס במים המבוסס על CUR.
Materials
| C. albicans | ATCC (Rockville, Md, USA) | 90028 | Used to prepare the Candida inoculum |
| Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany | 022628146 (NA) | Used to prepare the Candida inoculum |
| Chlorpromazine chloride 2 mg/mL | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to sedate animals during candida inoculation |
| Curcumin-based water-soluble salt | PDTPharma, Cravinhos, Brazil | - | Consisting of 53.4% of natural curcumin, and 46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1) |
| Digital colony counter | CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil | - | Used to count colonies on agar plates |
| Extruded mouse chow | Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil. | - | Used for the feeding of the mice |
| Ketamine Hydrochloride 10% | Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used to anesthetize animals before treatments and for euthanasia |
| Light-emitting diode handpiece (prototype) | Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil | - | Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA |
| Methylprednisolone acetate 40 mg | DEPO-MEDROL, Pfizer, New York | - | Used as an immunosuppressant |
| Microtome | Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA | SM2500 | Used to cut the serial sections of the tongues |
| Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm | Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil | - | Used to keep the animals throughout the experimental period |
| Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol | HiMedia, Mumbai, India | MM1067-500G | Culture medium for yeast growth (agar) |
| Spectrophotometer | Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil | K37-VIS | Used to standardize the inoculum concentration |
| Tetracycline hydrochloride | Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil | - | Antibiotic given to induce oral dysbiosis |
| Wood shavings | J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil | - | Used for floor covering inside the housing boxes |
| Xylazine 2% | Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil | - | Used in combination with ketamine for anesthesia |
| Yeast Nitrogen Broth | Difco, InterLab, Detroit, MI, USA | DF0919-07-3 | Culture medium for yeast growth (broth) |
| Yeast Peptone Dextrose Broth | NutriSelect Basic, Sigma Aldrich | Y1375 | Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow |
References
- Vila, T., Sultan, A. S., Montelongo-Jauregui, D., Jabra-Rizk, M. A. Oral candidiasis: a disease of opportunity. Journal of fungi (Basel, Switzerland). 6 (1), 15 (2020).
- Sudbery, P. E. Growth of Candida albicans hyphae. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).
- Moyes, D. L., Richardson, J. P., Naglik, J. R. Candida albicans-epithelial interactions and pathogenicity mechanisms: scratching the surface. Virulence. 6 (4), 338-346 (2015).
- Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
- Quindós, G., et al. Therapeutic tools for oral candidiasis: Current and new antifungal drugs. Medicina oral, patologia oral y cirugia buccal. 24 (2), e172-e180 (2019).
- Nishimoto, A. T., Sharma, C., Rogers, P. D. Molecular and genetic basis of azole antifungal resistance in the opportunistic pathogenic fungus Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (2), 257-270 (2020).
- Gholami, L., Shahabi, S., Jazaeri, M., Hadilou, M., Fekrazad, R. Clinical applications of antimicrobial photodynamic therapy in dentistry. Frontiers in Microbiology. 13, 1020995 (2013).
- Trigo-Gutierrez, J. K., Vega-Chacón, Y., Soares, A. B., Mima, E. G. O. Antimicrobial activity of curcumin in nanoformulations: a comprehensive review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7130 (2021).
- Santezi, C., Reina, B. D., Dovigo, L. N. Curcumin-mediated Photodynamic Therapy for the treatment of oral infections-A review. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 409-415 (2018).
- Dovigo, L. N., et al. Curcumin-mediated photodynamic inactivation of Candida albicans in a murine model of oral candidiasis. Medical Mycology. 51 (3), 243-251 (2013).
- Zangirolami, A. C., Carbinatto, F., Filho, J. D. V., Bagnato, V. S., Blanco, K. C. Impact of light-activated curcumin and curcuminoids films for catheters decontamination. Colloids and SurfacesB: Biointerfaces. 213, 112386 (2022).
- Santezi, C., Tanomaru, J. M., Bagnato, V. S., Júnior, O. B., Dovigo, L. N. Potential of curcumin-mediated photodynamic inactivation to reduce oral colonization. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 15, 46-52 (2016).
- Takakura, N., et al. A novel murine model of oral candidiasis with local symptoms characteristic of oral thrush. Microbiology and immunology. 47 (5), 321-326 (2003).
- Mima, E. G., et al. Susceptibility of Candida albicans to photodynamic therapy in a murine model of oral candidosis. OralSurgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology and Endodontology. 109, 392-401 (2010).
- Solis, N. V., Filler, S. G. Mouse model of oropharyngeal candidiasis. Nature Protocol. 7 (4), 637-642 (2012).
- Marôco, J. . Análise Estatística com o SPSS Statistics 25. , (2018).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS Microbiology Letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Experimental oral candidiasis in animal models. Clinical Microbiology Reviews. 14, 398-429 (2001).
- Chamilos, G., Lionakis, M. S., Lewis, R. E., Kontoyiannis, D. P. Role of mini-host models in the study of medically important fungi. The Lancet Infectious Diseases. 7, 42-55 (2007).
- Carmello, J. C., et al. Treatment of oral candidiasis using Photodithazine- mediated photodynamic therapy in vivo. PLoS One. 11 (6), e0156947 (2016).
- Sakima, V. T., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by curcumin-loaded polymeric nanoparticles in a murine model of oral candidiasis. Molecules. 23 (8), 2075 (2018).
- Abe, S., et al. A glucocorticoid antagonist, mifepristone affects anti-Candida activity of murine neutrophils in the presence of prednisolone in vitro and experimental candidiasis of prednisolone-treated mice in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 13 (4), 311-316 (1996).
- Jones, J. H., Russell, C., Young, C., Owen, D. Tetracycline and the colonization and infection of the mouths of germ-free and conventionalized rats with Candida albicans. Journal Antimicrobial Chemotherapy. 2 (3), 247-253 (1976).
- Russell, C., Jones, J. H. Effects of oral inoculation of Candida albicans in tetracycline-treated rats. Journal of Medical Microbiology. 6 (3), 275-279 (1973).
- Teichert, M. C., Jones, J. W., Usacheva, M. N., Biel, M. A. Treatment of oral candidiasis with methylene blue- mediated photodynamic therapy in an immunodeficient murine model. OralSurgery, Medicine, Pathology, Radiology and Endodontology. 93, 155-160 (2002).
- Totti, M. G. A., Santos, E. B., Almeida, O. P., Koga-Ito, C. Y., Jorge, A. O. C. Oral candidosis by Candida albicans in normal and xerostomic mice. Brazilian Oral Research. 18, 202-207 (2004).
- Hidalgo, K. J. R., et al. Antimicrobial photodynamic therapy in combination with nystatin in the treatment of experimental oral candidiasis induced by Candida albicans resistant to fluconazole. Pharmaceuticals (Basel). 12 (3), E140 (2019).
