הדמיה של פריציטים חיוניים ולא חיוניים במוח בפרוסות מוח לאחר דימום תת-עכבישי
Summary
החקירה הראשונית מאשרת כי דימום תת-עכבישי (SAH) גורם למוות של פריציטים במוח. הערכת התכווצות פריציטים לאחר SAH דורשת הבחנה בין פריציטים חיים ולא קיימא במוח. לפיכך, פותח הליך לסימון פריציטים במוח בני קיימא ושאינם בני קיימא בו זמנית בקטעי מוח, מה שמקל על תצפית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה.
Abstract
פריציטים הם תאי קיר חיוניים הממוקמים בתוך מיקרוסירקולציה מוחית, חיוניים בוויסות פעיל של זרימת הדם במוח באמצעות התאמות התכווצות. באופן קונבנציונלי, ההתכווצות שלהם נמדדת על ידי התבוננות בתזוזות מורפולוגיות ושינויים בקוטר הנימים הסמוכים בנסיבות ספציפיות. עם זאת, קיבוע לאחר רקמות, הערכת חיוניות והתכווצות פריציטים כתוצאה מכך של פריציטים במוח המודמיים נפגעים. באופן דומה, תיוג גנטי של פריציטים במוח אינו מבחין בין פריציטים בני קיימא ושאינם בני קיימא, במיוחד במצבים נוירולוגיים כמו דימום תת-עכבישי (SAH), שם החקירה הראשונית שלנו מאמתת את מותו של פריציטים במוח. פרוטוקול אמין פותח כדי להתגבר על אילוצים אלה, המאפשר תיוג פלואורסצנטי בו זמנית של פריציטים במוח תפקודיים ולא פונקציונליים באזורי מוח. שיטת תיוג זו מאפשרת הדמיה של מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה, ובו זמנית מסמנת את פרוסת המוח microvasculature. פרוטוקול חדשני זה מציע אמצעי להערכת התכווצות הפריציטים במוח, השפעתה על קוטר הנימים ומבנה הפריציטים. חקירת התכווצות פריציטים במוח בהקשר SAH מניבה הבנה מעמיקה של השפעותיה על מיקרו-סירקולציה מוחית.
Introduction
פריציטים במוח, המובחנים על ידי הבליטות הדקות שלהם וגופי התא הבולטים, מקיפים את microcirculation 1,2. בעוד שהגברת זרימת הדם במוח מונעת בעיקר על ידי התרחבות נימית, עורקים קטנים יותר מציגים קצב התרחבות איטי יותר3. התכווצות פריציטים משפיעה על קוטר הנימים ועל המורפולוגיה של הפריציטים, ומשפיעה על דינמיקת כלי הדם4. התכווצות של פריציטים במוח מובילה להתכווצות נימית, ובתרחישים פתולוגיים, התכווצות יתר עלולה לעכב את זרימת אריתרוציטים5. גורמים שונים, כולל נוראפינפרין המשתחרר מהלוקוס קורולוס, יכולים לגרום להתכווצות פריציטים במוח בתוך נימים6. עם תפקיד מווסת בזרימת הדם במוח, פריציטים מציגים סינתזת 20-HETE, ומשמשים כחיישן חמצן במהלך היפראוקסיה7. התכווצות המופעלת על ידי מתח חמצוני-חנקני של פריציטים במוח משפיעה לרעה על נימים5. למרות מחקרי in vivo ו-ex vivo על התכווצות פריציטים במוח8, קיים ידע מוגבל בנוגע לדימות של פריציטים מוחיים בני קיימא ובלתי ברי קיימא בתוך פרוסות מוח.
באופן מכריע, דימות לאחר קיבוע רקמות של פריציטים במוח פוגע בחיוניותם ובהערכת ההתכווצות שלאחר מכן. יתר על כן, בתרחישים כגון הפרעות נוירולוגיות (למשל, דימום תת-עכבישי – SAH), תיוג מהונדס של פריציטים במוח אינו מצליח להבדיל בין פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא, כפי שאושר במחקר המוות הראשוני שלנו של פריציטים במוח הנגרם על ידי SAH9.
כדי להתגבר על אתגרים אלה, השתמשנו ב-TO-PRO-3 כדי לתייג פריציטים חיים, בעוד שהמתים הוכתמו בפרופידיום יודיד (PI). השתמשנו בטכנולוגיות דימות קונפוקלי ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש פריציטים חיים ולא בני קיימא במוח בפרוסות מוח, תוך שמירה על פעילות הפרוסות במהלך ההדמיה. מאמר זה נועד להציג שיטה הניתנת לשחזור לדימות פריציטים ברי קיימא ושאינם בני קיימא במוח בפרוסות מוח, המשמשת ככלי רב ערך לחקירת ההשפעה של פריציטים במוח על מיקרו-סירקולציה מוחית לאחר SAH.
Protocol
Representative Results
Discussion
פותחו טכניקות הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה להדמיית פריציטים חיוניים במוח, פריציטים לא חיוניים במוח והמיקרו-כלי דם בפרוסות מוח. בפרוסות מוח חריפות של חולדות, התהליך כרוך בתיוג ראשוני של פריציטים עם TO-PRO-311, ואחריו תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עם IB412; לאחר מכן, זיהו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81960226,81760223); הקרן למדעי הטבע של מחוז יונאן (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
