Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Myndert Claasen; Zornitsa Kofinova; Matteo Contino; Weston B. Struwe

doi:10.3791/65772

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

생화학

ניתוח היווצרות קומפלקס חלבונים בריכוזים מיקרומולרים על ידי צימוד מיקרופלואידיקה עם פוטומטריית מסה

Published: January 26, 2024

doi:

10.3791/65772

Myndert Claasen¹, Zornitsa Kofinova¹, Matteo Contino², Weston B. Struwe^3,4

¹Refeyn Ltd., ²Adaptix Ltd., ³Physical and Theoretical Chemistry Laboratory, Department of Chemistry,University of Oxford, ⁴The Kavli Institute for Nanoscience Discovery,University of Oxford

Summary

פרוטוקול זה משלב פוטומטריית מסה עם מערכת מיקרופלואידיקה חדשנית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בעלות זיקה נמוכה. גישה זו מבוססת על דילול מהיר של קומפלקסים מרוכזים מאוד בתמיסה, המאפשר מדידות בעלות זיקה נמוכה ומרחיב את תחולת פוטומטריית המסה.

Abstract

פוטומטריית מסה היא טכנולוגיה רב-תכליתית למדידת מסה המאפשרת לחקור אינטראקציות ביומולקולריות והיווצרות מורכבת בתמיסה ללא תוויות. פוטומטריית מסה מתאימה בדרך כלל לניתוח דגימות בתחום הריכוז של 100 pM-100 ננומטר. עם זאת, במערכות ביולוגיות רבות, יש צורך למדוד דגימות מרוכזות יותר כדי לחקור אינטראקציות בעלות זיקה נמוכה או חולפות. כאן, אנו מדגימים שיטה המרחיבה ביעילות את טווח ריכוזי הדגימות שניתן לנתח באמצעות פוטומטריית מסה מננו-מולרית לעשרות מיקרומולאריות.

בפרוטוקול זה, פוטומטריית מסה משולבת עם מערכת מיקרופלואידיקה חדשנית כדי לחקור את היווצרותם של קומפלקסים חלבוניים בתמיסה בטווח ריכוזי המיקרומולרים. באמצעות מערכת המיקרופלואידיקה, המשתמשים יכולים לשמור דגימה בריכוז גבוה יותר הרצוי ולאחר מכן דילול לטווח הננו-מולרי – מספר אלפיות שנייה לפני מדידת פוטומטריית המסה. בשל מהירות הדילול, הנתונים מתקבלים לפני שיווי המשקל של המדגם השתנה (כלומר, דיסוציאציה של המכלול).

הטכניקה מיושמת למדידת אינטראקציות בין נוגדן אימונוגלובולין G (IgG) לבין קולטן Fc בילוד, ומראה היווצרות קומפלקסים מסדר גבוה שלא היו ניתנים לכימות עם מדידות פוטומטריה של מסה סטטית.

לסיכום, השילוב של פוטומטריית מסה ומיקרופלואידיקה מאפשר לאפיין דגימות בתחום ריכוזי המיקרומולרים ובקיא במדידת אינטראקציות ביומולקולריות בעלות זיקות חלשות יותר. יכולות אלה יכולות להיות מיושמות במגוון הקשרים – כולל פיתוח ועיצוב של תרופות ביותרפיות – ומאפשרות אפיון יסודי של אינטראקציות חלבון-חלבון מגוונות.

Introduction

אינטראקציות חלבון-חלבון מדגישות את רוב תפקודי התאים, החל מוויסות חיסוני ועד שכפול ותרגום DNA. כתוצאה מכך, קיים צורך בסיסי לאורך מדעי החיים לחקור מגוון רחב של אינטראקציות על פני קומפלקסים הטרוגניים מגוונים הנוצרים בדרך כלל. עם זאת, האיתור, האפיון והכימות שלהם הם לעתים קרובות מאתגרים, במיוחד עבור אינטראקציות בעלות זיקה נמוכה¹.

מבחני משקעים חיסוניים משמשים לעתים קרובות לזיהוי אינטראקציות בעלות זיקה גבוהה, אך עבור אינטראקציות בעלות זיקה נמוכה ואינטראקציות חולפות, הזיהוי אינו אפשרי במידה רבה². ניתן להשתמש גם בטכניקות פלואורסצנטיות אך דורשות הוספה שעלולה להפריע לתוויות פלואורסצנטיות². Cryo-EM יכול לספק תמונת מצב מבנית וקריאת אנסמבל של קומפלקסים חלבוניים שנוצרו ברזולוציה מרחבית גבוהה, אך גם בדרך כלל דורש עבודה בריכוזים נמוכים מדי עבור הדמיה של אינטראקציות בעלות זיקה נמוכה. Cryo-EM מביא גם אתגרים הקשורים לעלות, נגישות, הכנת מדגם וזמן ניתוח³.

בנוסף, תהודה פלסמונית פני השטח (SPR) הפכה לדרך פופולרית לכימות אינטראקציות חלבון-חלבון, אם כי היא דורשת אימוביליזציה של חלבון, אשר יכולה להשפיע על שיווי המשקל הקושר ולגרום לקצבי על משתנים, ובכך להפחית את דיוק המדידה ^4,5. זה כולל גם כמה שלבי בדיקה לפני איסוף נתונים וניתוח⁶.

פוטומטריית מסה היא טכניקה של מולקולה אחת ששימשה לניתוח אינטראקציות חלבון-חלבון ^5,6,7. זה עובד על ידי מדידת המסה של מולקולות בודדות או קומפלקסים בהתבסס על האור שהם מפזרים כאשר הם נוחתים על פני השטח של כיסוי זכוכית⁸. מדידות פוטומטריית מסה שימשו לכימות זיקות קשירה מהשפע היחסי של שותפי קישור והקומפלקסים שהם יוצרים⁵. עם זאת, בדומה לטכניקות אחרות של מולקולה בודדת, ריכוז הדגימה שתימדד צריך להיות בדרך כלל פחות מ-100 ננומטר. אם הריכוז גבוה יותר, המולקולות שנוחתות על משטח הזכוכית יחפפו מרחבית, וכתוצאה מכך איכות הנתונים תהיה ירודה⁷. כתוצאה מכך, אינטראקציות חלשות יותר (K_D ~micromolars), המתנתקות בריכוזים נמוכים אלה, אינן ניתנות למדידה מהימנה מכיוון שלא ניתן לצפות בתערובת ההכרחית של מינים לא קשורים וקשורים⁵.

כאן, אנו מתארים גישה המתגברת על מגבלה זו המבוססת על מכשיר פוטומטריית מסה מיקרופלואידיקה מצומד חדש. באופן ספציפי, מערכת מיקרופלואידיקה משמשת בשילוב עם פוטומטר המסה כדי להרחיב ביעילות את טווח האינטראקציות שניתן לכמת על ידי פוטומטריית מסה. מיקרופלואידיקה הוכחה כמציעה מגוון אפשרויות לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון, כולל דילול מהיר לזיהוי אינטראקציות חלשות ^1,9. המערכת המתוארת כאן פועלת על ידי דילול מהיר של הדגימה עד פי 10,000 על שבב מיקרופלואידי והזרמתה באופן מיידי על פני אזור התצפית של השבב, מה שמאפשר למדידת פוטומטריית המסה להתחיל תוך 50 מילישניות מהרגע שבו החלו המולקולות בתהליך הדילול¹⁰. הדילול מתרחש כאשר הדגימה והמאגר משולבים במערבל שסתום טסלה הפוך על השבב, כאשר קצבי הזרימה היחסיים של שתי התמיסות קובעים את כמות הדילול המתרחשת (ראה שלב פרוטוקול 8). קצב הזרימה ניתן לשליטה באמצעות תוכנת הבקרה המיקרופלואידית. שינוי קצב הזרימה יכול לשנות את האוכלוסייה היחסית של המין מכיוון שהוא יכול להשפיע על מספר אירועי הנחיתה על פני הזכוכית, וזה מה שנמדד על ידי פוטומטר המסה.

מהירות התהליך מהירה מספיק כדי להשלים את המדידה לפני שתקינות האינטראקציה תשובש (לפרטים נוספים, ראו גם את הדיון). ניתן להבין זאת באמצעות מבט קצר על התיאוריה של תגובות מסדר ראשון, כאשר . קבוע קצב האסוציאציה קדימה הוא k_f, קבוע הקצב לאחור (דיסוציאציה) הוא k_b, וקבוע דיסוציאציית שיווי המשקל (K_D) מוגדר כ

K_D = k_b/ k_f

עבור קשירת חלבונים, k_fמוגבל בדרך כלל על ידי הדיפוזיה¹¹ של המגיבים ולכן מוגבל לטווח של 10 6-10 ⁷ ^M-1·^s-1. מכיוון שהטווח של מוגבל, לתגובה בעלת זיקה נמוכה (K_D~micromolars) תהיה k_b≈ 1 ^s-1. כלומר, k_b = k_f · K_D = (10⁶ ^M-1·^s-1) (10-6 M) = 1 ^s-1, כאשר זמן מחצית החיים של המתחם נע סביב 0.7 s^11,12.

המערכת לדוגמה שלנו היא קשירה של נוגדן חד-שבטי IgG trastuzumab לתחום המסיס של קולטן Fc בילוד IgG (FcRn), שהם שותפים ידועים באינטראקציה¹³. נתונים שפורסמו בעבר שהתקבלו באמצעות פוטומטריית מסה קונבנציונלית בלבד (כלומר, עם דילול ידני של דגימות) הראו כי החלבונים יוצרים מינים מרובים. מונומרים של FcRn, דימרים של FcRn ו-IgG לא קשור נראו בבירור, בעוד שקומפלקסים של IgG-FcRn (ביחס של 1:1 ו-1:2) זוהו גם הם (ב-pH 5.0) אך רק עם שפע נמוך מאוד⁵. תצפית זו מעלה את השאלה האם ניתן לזהות בבירור רב יותר היווצרות קומפלקס IgG-FcRn אם נמדדת בריכוז גבוה יותר. ואכן, שילוב פוטומטריית מסה עם גישת דילול מהיר מצומד שתוארה כאן סיפק ראיות חזקות יותר להיווצרות מורכבת על ידי עלייה בחלקיקים הנמדדים שלהם.

פרוטוקול פוטומטריית המסה והמיקרופלואידיקה המתואר כאן מאפשר לאפיין היווצרות קומפלקסים עם K_D עד לטווח המיקרומולארי. קביעה אמפירית של K_D תדרוש שיפורים נוספים בדיוק חיישן הזרימה, יציבות המשאבה, וריאציות שבב לשבב ומיקום המדידה בתוך חלון התצפית, שכן כל הגורמים הללו ישפיעו על הזמן מרגע דילול הדגימה ועד למדידה.

אותה גישה יכולה להיות מיושמת כדי לחקור קשירה בין חלבונים מסיסים, בתנאי שיש להם משקלים מולקולריים נפרדים (מופרדים על ידי לפחות 25 kDa) הנמצאים בטווח המתאים לניתוח עם פוטומטר מסה (30 kDa עד 6 MDa). התובנות המתקבלות יכולות להיות מועילות למחקרים במגוון הקשרים – החל מהשגת הבנה מכניסטית של תפקודים תאיים ועד לתכנון תרופות ביותרפיות חדשות.

Protocol

1. הכנת המכשירים והפעלת התוכנה הפעל את פוטומטר המסה והשאר אותו דולק לפחות שעה אחת לפני תחילת מדידות כלשהן.הערה: הסיבה לכך היא שהמכשיר צריך להגיע לטמפרטורה קבועה. אי השארת פוטומטר המסה דולק למשך שעה אחת עלולה להוביל לשינוי מסה, ולכן לתוצאות לא מדויקות. הפעל את השולחן נגד רטט על ידי הפעלת ההפעלה ולחיצה על לחצן הבידוד (מתחת לפוטומטר המסה). תנודות מגבילות את הביצועים של מכשיר פוטומטריית המסה, ולכן השולחן נגד רטט חשוב כדי להבטיח רגישות מקסימלית של המכשיר. הפעל את התיבה microfluidics. הפעל את תוכנת רכישת הנתונים ואת תוכנת הבקרה microfluidics. הפעל את מדחס האוויר. 2. הכנת דגימות חלבון, חיץ ותמיסות ניקוי הוסף 200 מ”ל של חיץ PBS (pH 7.4) לבקבוק נקי של 200 מ”ל ו-200 מ”ל של חיץ PBS (pH 5.0) לבקבוק שני של 200 מ”ל.הערה: הבקבוקים בנפח 200 מ”ל יצטרכו להיות מחוברים לחיישן יחידת הזרימה “L” בשלבים הבאים. השתמש במאגר pH 7.4 PBS למדידת הכיול ובמאגר pH 5.0 PBS למדידת הדגימה. בצינור צנטריפוגה של 0.5 מ”ל, מערבבים IgG (2 μM) ו-FcRn (20 μM) ביחס של 1:10 לקבלת נפח כולל של 60 μL.פתרונות המניות עבור FcRn ו- IgG הם 91.9 מיקרומטר ו- 13.5 מיקרומטר, בהתאמה. הכן את התגובה על ידי ערבוב 9 μL של מלאי IgG + 13 μL של מלאי FcRn + 38 μL של PBS (pH 5.0, טמפרטורת החדר [RT]) בצינור צנטריפוגה עבור נפח כולל של 60 μL. הריכוזים הסופיים עבור שני המגיבים היו 2 מיקרומטר עבור IgG ו-20 מיקרומטר עבור FcRn. שמרו את כל מלאי החלבון על קרח לאורך כל התהליך הזה. בצינור צנטריפוגה נוסף של 0.5 מ”ל, יש להוציא 20 מיקרוליטר של כיול β-עמילאז בריכוז של 20 מיקרומטר.לדוגמה, כדי להכין את כיול β-עמילאז המשמש כאן, בצע את ההליך המתואר ב- 2.3.1.1-2.3.1.2.יש להשהות 20 מ”ג אבקת β-עמילאז בבקבוקון ב-3.57 מ”ל PBS (5% גליצרול), המקביל ל-5.6 מ”ג/מ”ל וריכוז מולארי של 100 מיקרומטר (שכן המשקל המולקולרי הוא 56 kDa). כדי לדלל ל-20 מיקרומטר, שלב 200 מיקרוליטר ממלאי 100 מיקרומטר עם 800 מיקרוליטר PBS (pH 7.4, RT) בצינור צנטריפוגה של 1 מ”ל. דגרו על הדגימות ב-RT למשך 30 דקות לפחות.הערה: התחל להכין את הדגימה ואת דילול הכיול לאחר הפעלת פוטומטר המסה. לצורך ניסוי זה, הדגימות הודגרו במשך 120 דקות. בשלושה צינורות צנטריפוגות 50 מ”ל, aliquot: 50 מ”ל של PBS (pH 7.4) – פתרון ניקוי 1 (CS1), 50 מ”ל של 0.5 M NaOH – פתרון ניקוי 2 (CS2), ו 50 מ”ל של 100% IPA – פתרון ניקוי 3 (CS3). 3. מערך ניסיוני כדי לטעון את הדגימה ואת הכיול, מקם את צינור הצנטריפוגה המכויל במיקום 4 ואת צינור הצנטריפוגה לדוגמה במיקום 5 של תיבת המיקרופלואידיקה (איור 1). כדי לטעון את פתרונות הניקוי, מקמו את CS1, CS2 ו-CS3 במיקומים 1, 2 ו-3 של תיבת המיקרופלואידיקה (איור 1).הערה: פתרונות הדגימה, הכיול והניקוי מחוברים למתג הרב-מתג (m-switch). מתג ה-m מחובר לחיישן יחידת הזרימה “S”. הברג את הפקק המתחבר לקו החיץ אל בקבוק החיץ בנפח 200 מ”ל (pH 7.4).הערה: קו החיץ מחובר לשסתום כיבוי, המחובר לחיישן יחידת הזרימה “L”. שסתום הכיבוי מונע תופעות סיפון שעלולות להתרחש כאשר זרימת החיץ מופסקת. סיפון יכול להוביל לזיהום של החיץ מהנוזל השיורי המדולל החוזר למאגר החיץ. מניחים את שבב המיקרופלואידיקה על צלחת הכנה.דחפו את הקצה השני של חיישן יחידת הזרימה “S” לתוך “כניסת הדגימה” של התעלה הראשונה בשבב המיקרופלואידיקה (איור 1). שורת הדגימה הושלמה. דחפו את הקצה השני של חיישן יחידת הזרימה “L” לתוך “כניסת החיץ” של התעלה הראשונה בשבב המיקרופלואידיקה (איור 1). קו החיץ הושלם. כדי לאסוף את היציאה, לדחוף צינור אל “יציאה” של הערוץ הראשון שבב microfluidics; מקמו את הקצה השני כך שהוא יתנקז לבקבוק או לכוס פסולת (איור 1). 4. הקדמת קווי הדגימה והחיץ עם חיץ פתח את שסתום הכיבוי הידני בקו החיץ. בתוכנת הבקרה של מיקרופלואידיקה, הגדר את קצב זרימת קו החיץ ל- 1000 מיקרוליטר/דקה וודא שלחץ קו החיץ אינו עולה על 110 mbar (איור 2). הזרימה תתחיל באופן אוטומטי בקו החיץ (איור 1).הערה: אם לחץ קו החיץ עולה על 110 mbar, ייתכן שהסיבה לכך היא אוויר העובר דרך חיישן הזרימה. אם הלחץ לא חוזר לנורמה תוך מספר שניות, עלולה להיות חסימה (בדרך כלל עקב צינורות מכווצים בחיבורים). במקרה כזה, עצור את הזרימה ובדוק את החיבורים בקו החיץ, החל משסתום הכיבוי. בתוכנת הבקרה microfluidics, בחר מיקום 1 של מתג m (המתאים למאגר PBS), ולאחר מכן הגדר את קצב זרימת קו הדגימה ל- 8 μL/min וודא שלחץ קו הדגימה אינו עולה על 350 mbar. הזרימה תתחיל באופן אוטומטי בשורת הדגימה (איור 1). השתמש בקצה פיפטה (או רכיב פלסטיק רך אחר) כדי להפעיל לחץ עדין מלמעלה ליד הבועות הכלואות בשבב כדי לעקור בועות אוויר ולוודא שהן מוסרות דרך השקע.הערה: הקפידו להסיר את כל הבועות במקטעים ‘מיקסר’ ו’אזור תצפית’ (איור 1) של התעלה שבשימוש. היזהר לא לדחוף חזק מדי, כמו זה עלול לפגוע שבב. 5. הנחת שבב המיקרופלואידיקה על פוטומטר המסה ומציאת הפוקוס החל טיפה של שמן טבילה במיקרוסקופ על המטרה של פוטומטר המסה. הניחו את שבב המיקרופלואידיקה על מחזיק פוטומטר המסה כאשר “מפרצון הדגימה” פונה כלפי מעלה והחזיקו אותו מחובר למהדקי הבמה (איור 1). ודא שכל חיבורי הצינורות נשארים מחוברים. באמצעות תוכנת איסוף הנתונים, הזיזו את השלב כדי לוודא ש”אזור התצפית” של ערוץ 1 מיושר עם המטרה (איור 1). סגור את מכסה הפוטומטר ההמוני ולחץ על האפשרות Droplet-Dilution Find Focus בתוכנת איסוף הנתונים. בדוק את טבעת המיקוד הלבנה בפינה השמאלית התחתונה של תוכנת איסוף הנתונים (איור 3). פערים בטבעת מצביעים על נוכחות של בועת אוויר בשמן הטבילה; הסר זאת על ידי הגדלת מהירות הבמה למקסימום והזזת הבמה לרוחב בעדינות. לאחר השלמת המיקוד, המתן 2-3 דקות לפני ביצוע ההקלטה הראשונה. לאחר מכן, לחץ על הקלט כדי להקליט מדידה של דקה אחת ולוודא (על ידי צפייה במדידה) שלא מופיעים זיהומים.הערה: זיהומים יכולים להיות על משטח הזכוכית או בחיץ. ערך החדות בתוכנת איסוף הנתונים צריך להיות מעל 4.5%. 6. כיול פוטומטריה מסה בתוכנת הבקרה של המיקרופלואידיקה, העבר את מתג m למצב 4 (המתאים לכיול) וודא שקצב זרימת קו הדגימה מוגדר על 8 μL/min ולחץ קו הדגימה אינו עולה על 350 mbar (איור 2).הכיול יתחיל את הזרימה דרך השבב. המתן כ-1.5-2.5 דקות (או עד שהכיול ייראה באופן עקבי בתוכנת איסוף הנתונים). הזמן עשוי להשתנות בהתאם לאורך צינורות קו הדגימה. ברגע שהכיול נראה באופן עקבי (כלומר, מספר האירועים מספיק למדידת פוטומטריית מסה מדויקת), בתוכנת הבקרה של המיקרופלואידיקה, הפחיתו את קצב הזרימה ל-0.5 מיקרוליטר/דקה – רמת דילול המטרה של ניסוי זה.הערה: התחלה עם קצב זרימה גבוה יותר פשוט מפחיתה את הזמן הדרוש לכיול להגיע לשבב. ודאו שאין מולקולות “מעטות מדי” או “רבות מדי” שנוחתות על משטח המדידה (איור 4).אם צפיפות אירוע הנחיתה אינה “אידיאלית” (איור 4), שנו את קצב הזרימה בתוכנת הבקרה של המיקרופלואידיקה. אם צפיפות האירוע נמוכה מדי, הגדל את קצב זרימת הדגימה עד לצפייה באירועי נחיתה מופרדים היטב (אך לא יעלה על 8 מיקרוליטר לדקה). אם הוא גבוה מדי, הפחיתו את קצב זרימת הדגימה (אך אל תעברו מתחת ל-0.1 מיקרוליטר/דקה). אם עוצמת הקול המכיילת נמוכה בצינור הדגימה, שנה את מיקום מתג m לקו PBS pH 7.4 (מיקום 1) כדי למנוע הזרקת אוויר. לחץ על הקלט ובצע מדידה של 60 שניות. שמור את הקובץ בתיקיה שנבחרה.הערה: תוכנת רכישת הנתונים מייצרת קבצים עם סיומת .mp. 7. ניקוי קו הדגימה ועצירת הזרימה בתוכנת הבקרה של המיקרופלואידיקה, עברו למיקום 2 של מתג m ושנו את לחץ הדגימה ל-800mbar (איור 2). שטפו את המערכת עם CS2 (NaOH) למשך 4 דקות. עבור למצב 3 של מתג m ושטוף את המערכת עם CS3 (IPA) למשך 4 דקות. עבור למיקום 1 של מתג m ושטוף את המערכת עם CS1 (PBS) למשך 4 דקות. בתוכנת הבקרה microfluidics, עצור את כל הזרימה על ידי הגדרת לחצי קו הדגימה וקו החיץ ל- 0 וכבה את שסתום החיץ. נתקו את השבב מהבמה והחזירו אותו לצלחת ההכנה. נתקו את כל הצינוריות והכניסו את קצה הצינור לדוגמה לבקבוק פסולת. נקו את המטרה עם איזופרופנול ומגבונים. 8. מדידת דגימת פוטומטריית המסה פתח את הברגת הפקק המחובר לבקבוק החיץ של 200 מ”ל (pH 7.4) והברג אותו לבקבוק החיץ של 200 מ”ל (pH 5.0). חזור על שלבים 3.4-5.6, אך השתמש בערוץ השני של השבב במקום הראשון. בתוכנת הבקרה של המיקרופלואידיקה, העבר את מתג m למצב 5 (המתאים לדגימה), הגדר את קצב זרימת קו הדגימה ל- 8 μL/min, וודא שלחץ קו הדגימה אינו עולה על 350 mbar (איור 2). חזור על שלבים 6.2-6.4 כדי למדוד את הדגימה.כדי לחשב את קצבי הזרימה לשימוש, ודא שהפרש הקיפול בקצב הזרימה תואם לגורם דילול הדגימה הרצוי. לדוגמה, כדי להשיג דילול של 2000x כאן, שיעורי הזרימה שונים בפקטור של 2000; קצב זרימת המאגר הוא 1000 מיקרוליטר/דקה, וקצב זרימת הדגימה הוא 0.5 מיקרוליטר/דקה. בסוף ניסוי, תמיד להשאיר את הקווים נקיים על ידי ביצוע פרוטוקול הניקוי. 9. ניתוח נתונים לאחר השלמת איסוף הנתונים, הפעל את תוכנת ניתוח הנתונים (איור 5). לחץ על סמל הפלוס (+) בפינה השמאלית העליונה ובחר את קובץ הכיול .mp. התוכנה תתחיל לנתח את הקובץ שנטען. בהתאם לגודל ולמספר המדידות, פעולה זו עשויה להימשך מספר דקותאל תנתח קבצי .mp בתוכנת ניתוח הנתונים בעת רכישת נתונים באמצעות תוכנה לרכישת נתונים, מכיוון שהדבר עלול לפגוע באיכות הנתונים הנרכשים. לחץ על הלחצן צור כיול מסה (בפינה השמאלית התחתונה). תיפתח תיבת דו-שיח המציגה טבלה המאוכלסת בערכי הניגודיות של הפסגות המותאמות. שנה את הערכים לערכי המסה הידועים עבור הפסגות המותאמות (עבור β-עמילאז ערכים אלה הם 56 kDa, 112 kDa ו- 224 kDa) ולחץ על Save. קובץ הכיול החדש שנוצר (סיומת .mc) יופיע בחלונית Mass Calibration (בפינה השמאלית התחתונה של תוכנת ניתוח הנתונים) (איור 6). לחץ על סמל החיבור (+) בפינה השמאלית העליונה ובחר את הקובץ לדוגמה .mp. כדי ליצור היסטוגרמה של מסה, כפי שמוצג באיור 5, עבור אל הכרטיסיה ניתוח , בחר במצב היסטוגרמה ובאפשרות התוויית מסה . התאם את רוחב האשפה, מגבלות המסה ופרמטרים אחרים לפי הצורך. אם תרצה, התאם אישית את ההתוויה בכרטיסייה ‘איורים ‘ לפני ייצוא איורים ו/או שמירת סביבת העבודה כולה כקובץ .dmp.

Representative Results

פוטומטריה המונית שימשה למדידת האינטראקציה בין נוגדן IgG חד שבטי trastuzumab לבין התחום המסיס של קולטן Fc בילוד IgG (FcRn). תערובת של 1:10 של שני החלבונים (ב-2 מיקרומטר עבור IgG ו-20 מיקרומטר עבור FcRn) דוללה ידנית ל-10 ננומטר ו-20 ננומטר ב-PBS, בהתאמה. שלב הדילול הכרחי מכיוון שפוטומטריית מסה, טכניקה למדידת מסה של מולקולה יחידה, יכולה לנתח רק דגימות בטווח של 100 pM-100 ננומטר. ניסיון למדוד דגימות עם ריכוזים מחוץ לטווח הזה יכול לסכן את דיוק התוצאות (איור 4). ניסוי זה אינו נכלל בפרוטוקול זה, כפי שתואר בעבר 5,6. בהיסטוגרמות המסה המיוצרות בניסוי פוטומטריית מסה, עוצמת אות הפיזור (או “הניגוד”) עבור כל אירוע נחיתה משורטטת על ציר ה-x, והיא מומרת למסה מולקולרית באמצעות שלב כיול מסה-ניגודיות. בינתיים, ציר ה-y מציין את מספר המולקולות הנספרות עם מסה (או ניגוד) נתונה. לכן, שיא מציין נוכחות של אוכלוסיית מולקולות בטווח המשקלים המולקולריים המוצגים על ציר ה-x. מספר האירועים (ספירות) המרכיבים את השיא משקף את גודל האוכלוסייה. מדידת פוטומטריית המסה עם דילול ידני הביאה להיסטוגרמה של מסה שבה שתי הפסגות הגדולות ביותר, בהתבסס על המשקל המולקולרי הצפוי של החלבונים, התאימו למונומרים FcRn לא קשורים (~50 kDa) ולמונומרים של נוגדני IgG (~150 kDa) (איור 7). בדומה לנתוני פוטומטריית המסה5 שפורסמו בעבר, המינים הבלתי קשורים היו בולטים, בעוד שפסגות בטווחי המסה שיתאימו לקומפלקסים היו הרבה פחות בולטות. הניסוי חזר על עצמו באמצעות מערכת מיקרופלואידיקה בדילול מהיר כדי לדלל את התערובת לריכוז הדרוש מיד לפני מדידת פוטומטריית המסה. גישה זו אפשרה זיהוי של קומפלקסים נוספים בעלי זיקה נמוכה, שייתכן שהתנתקו במהלך שלב הדילול הידני. כדי להשיג את אותו גורם דילול של 2000x ששימש במהלך ניסוי הדילול הידני, תערובת הדגימה ביחס של 1:10 (בריכוז של 2 מיקרומטר עבור IgG ו-20 מיקרומטר עבור FcRn) הוזרמה אל השבב המיקרופלואידי בקצב של 0.5 מיקרוליטר/דקה, יחד עם חיץ PBS (pH 5.0) בקצב זרימה של 1 מ”ל/דקה. כדי להבטיח שהחלבונים לא התפרקו בזמן המדידה, IgG (2 μM) ו-FcRn (20 μM) נמדדו בזרימה עם מערכת המיקרופלואידיקה לאחר 120 דקות של דגירה של הדגירה. מדידות בקרה פרטניות לא הראו פירוק חלבונים (איור משלים 1) עבור המדגם שעבר דילול מהיר, ניתן היה לצפות שוב בפסגות המתאימות למונומרים FcRn (53 kDa), דימרים FcRn (97 kDa) ומונומרים מסוג IgG (148 kDa). כמו כן, שתי פסגות נוספות נצפו בבירור ב-196 kDa וב-251 kDa, בהתאמה לקומפלקסים מסוג IgG-FcRn עם סטויכיומטריות ביחס של 1:1 ו-1:2 (איור 7). המסות הצפויות עבור שני קומפלקסים אלה היו 200 kDa ו 250 kDa, בהתאמה. השונות במדידת המסה היא במסגרת טעות המדידה עבור פוטומטר המסה ששימש במחקר זה היא ±5 (2% עבור קומפלקס 1:1 ו-0.4% עבור קומפלקס 1:2). נוכחותם של קומפלקסים אלה רק במדגם המדולל במהירות עולה בקנה אחד עם הרעיון שהם נוטים להתנתק בריכוזים נמוכים יותר, בקצב שהוא מהיר יחסית לתהליך דילול ידני אך איטי ביחס לתהליך הדילול המהיר המושג במערכת המיקרופלואידיקה15. איור 1: שילוב מיקרופלואידיקה עם פוטומטריית מסות. (A,B) קופסת המיקרופלואידיקה המשמשת בפרוטוקול זה, כפי שניתן לראות מחזית (A) ו-(B) למעלה. תמיסות הניקוי ממוקמות בעמדות 1-3, והדגימות והכיולים ממוקמים בעמדות 4-6. כל הפתרונות מחוברים למתג m, המחובר לחיישן יחידת זרימה “קטן”. (ג) סקירה כללית של המערכת כולה. המחשב (למעלה משמאל) מחובר לתיבת מיקרופלואידיקה (מוצגת בצמוד למאגר ולצינורות הדגימה) ולפוטומטר המסה (למטה מימין), שם ממוקם שבב המיקרופלואידיקה. צג קצב הזרימה הקטן (FRMS) מנטר את הזרימה דרך קו הדגימה, בעוד שצג קצב הזרימה הגדול (FRML) מנטר את זרימת החיץ. צינורות הדגימה וקו החיץ מתחברים לתעלה על שבב המיקרופלואידיקה, הממוקמת בתוך פוטומטר המסה. (D) לכל שבב יש שלושה ערוצים. FRMS מחובר לכניסת הדגימה ו- FRML לכניסת המאגר. אזור המיקסר הוא המקום בו מתבצע דילול דגימה מהיר, ואילו אזור התצפית הוא המקום בו מתבצעות מדידות פוטומטריית המסה. השקע מנוטר על ידי חיישן זרימה נוסף כדי לוודא שאין דליפות בשבב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: תוכנת הבקרה של מיקרופלואידיקה. בעזרת תוכנה זו, הגדר ועקוב אחר קצבי הזרימה, קווי הלחץ של מערכת המיקרופלואידיקה ומיקום המתג הרב-מתג (m-switch). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: זיהוי נוכחות של בועות בשמן. הדוגמאות מתוכנת איסוף הנתונים מראות טבעת מיקוד ברורה ובלתי שבורה (משמאל) וטבעת ‘שבורה’, המעידות על נוכחות בועות אוויר בשמן הטבילה (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: דוגמאות מייצגות של ריכוזי דגימות שבהם מספר אירועי הנחיתה של מולקולות הוא מועט מדי, אידיאלי או רב מדי. מולקולות הנוחתות על פני השטח של אזור התצפית בשבב המיקרופלואידיקה יופיעו ככתמים כהים בתצוגה היחסימטרית של תמונת פוטומטריית המסה. באופן אופטימלי, הריכוז הרצוי אמור לאפשר צפיפות אידיאלית של אירועי נחיתה להתרחש במהלך רכישת נתונים (באמצע). אם צפיפות אירוע הנחיתה נמוכה מדי (למעלה, “מעט מדי”), לא ניתן להשלים ניתוח סטטיסטי מדויק של נתוני פוטומטריית המסה. אם הוא גבוה מדי (למטה, “יותר מדי”), מולקולות הנחיתה יחפפו מרחבית, מה שיגרום לאיכות נתונים ירודה. תמונות אלה צולמו באמצעות תוכנת איסוף הנתונים באמצעות פוטומטר המוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: לכידת מסך של תוכנת ניתוח הנתונים לפוטומטריית מסה. כאן, ניתן לטעון את קבצי ה- .mp המיוצאים מתוכנת רכישת הנתונים כדי לנתח את הנתונים. ניתן להפיק נתונים מהנתונים המעובדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: לכיול ניגודיות מסה עבור ניסוי זה. הכיול בו נעשה שימוש היה β-עמילאז, הידוע כיוצר שלושה מינים: מונומר (56 kDa), דימר (112 kDa) וטטרמר (224 kDa). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: היסטוגרמות מסה חושפות היווצרות מורכבת רק לאחר דילול מהיר של הדגימה. היסטוגרמות מסה והתפלגויות גאוס המתאימות ביותר מוצגות למדידות של דגימות המכילות IgG ו- FcRn לאחר דילול ידני (כתום) או דילול מהיר באמצעות מערכת microfluidicsHC (כחול). תוויות המסה מציינות שהערכים הממוצעים מעקומות גאוס מתאימים להיסטוגרמות המסה שנמדדו לאחר דילול מהיר. לאחר דילול ידני, נצפו פסגות המתאימות למונומרים FcRn (52 kDa, כפי שנמדד בדילול ידני) ומונומרים מסוג IgG (152 kDa). לאחר דילול מהיר, בנוסף למונומרים FcRn ו- IgG, נצפו בבירור גם פסגות המתאימות לדימרים FcRn ולמתחמי IgG-FcRn עם סטויכיומטריה של 1:1 ו- 1:2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. נתונים משלימים איור 1: מדידות פוטומטריה המוניות של דגימות ביקורת לאחר דילול מהיר אינן מראות פירוק חלבון. (A) היסטוגרמה של מסה והתפלגות גאוס המתאימה ביותר עבור מדגם FcRN בלבד. ריכוז הדגימה הראשוני לפני דילול מהיר היה 20 מיקרומטר, וקצב הזרימה נקבע ל-0.5 מיקרוליטר/דקה. ניתן היה להבחין בשיאי מסה המתאימים למונומרים FcRn (53 kDa) ודימרים FcRn (97 kDa). (B) היסטוגרמה של מסה והתפלגות גאוסיאנית המתאימה ביותר עבור מדגם IgG (הרצפטין) בלבד. ריכוז הדגימה הראשוני לפני דילול מהיר היה 2 מיקרומטר, וקצב הזרימה נקבע ל-1 מיקרוליטר/דקה. ניתן היה להבחין בשיא מסה יחיד המתאים למונומר IgG (155 kDa). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה לזיהוי וכימות אינטראקציות חלבון-חלבון בעלות זיקה נמוכה. הוא משתמש בפוטומטר מסה המחובר למערכת מיקרופלואידיקה בעלת דילול מהיר. פוטומטריית מסה היא כלי ביואנליטי ללא תוויות שיכול למדוד באופן אמין מסה מולקולרית בתמיסה עבור ביומולקולות¹⁶, עבור אלה בטווח של 30 kDa עד 6 MDa. מכיוון שפוטומטריית מסה היא טכניקה של מולקולה בודדת המנתחת דגימות בזו אחר זו, היא מוגבלת בדרך כלל לדגימות בטווח הריכוז של 100 pM-100 ננומטר. מעל טווח זה, המולקולות הנוחתות על משטח הזכוכית יחפפו מרחבית, וכתוצאה מכך איכות הנתונים תהיה ירודה; מתחת לטווח זה, מעט מדי נתונים מתקבלים כדי לבצע ניתוח חזק⁷. תוצאה חשובה היא שהיא יכולה להגביל את חקירת אינטראקציות החלבונים לאלה היוצרות תערובת של מינים קשורים ולא קשורים בטווח זה.

כאן, פירטנו פרוטוקול שלב אחר שלב לשימוש במערכת מיקרופלואידיקה של דילול מהיר כדי להרחיב ביעילות את טווח ריכוזי הדגימות המקובלים לפוטומטריית מסה. על ידי דילול הדגימה על השבב המיקרופלואידי ולאחר מכן הזרמתה על פני חלון התצפית של הגלאי תוך 50 מילישניות, המערכת לוכדת את הקומפלקסים הקיימים בדגימה הלא מדוללת לפני שינוי שיווי משקל האינטראקציה. הדגימה מועברת ברציפות לגלאי במהלך מדידות בודדות. בתנאים אלה, 95% מהקומפלקס יישאר שלם בעת מדידת הדגימה, אפילו עבור אינטראקציות בעלות זיקה נמוכה – עם K_Dבסדר גודל של מיקרוטוחנות ושיעורי דיסוציאציה במהירות של 1 ^s-1.

ניתן לחשב זאת באופן הבא: עבור תגובה עם קצב קדימה k_fוקצב אחורה k_b,

בשיווי משקל, הריכוזים של כל שלושת המינים (A, B והקומפלקס AB) נשארים קבועים, כך ו – . תחת ההנחה השמרנית שההפרעה (דילול, במקרה זה) עלולה לגרום למורכבות להתנתק, אך תגובת האסוציאציה קדימה אינה מתקדמת, ניתן להתייחס למונח k_f[A] [B] כזניח, וניתן לבצע את הפישוט הבא:

אינטגרציה נותנת את הביטוי הבא לריכוז של קומפלקס בזמן לאחר הפרת שיווי המשקל:

החלק של המכלול שנשאר קשור בזמן t לאחר הפרת שיווי המשקל הוא כך:

ב- = 50 אלפיות השנייה, עבור תגובה עם k_b≈ 1 ^s-1, חסם השבר הוא 0.95, או 95%^11,12.

פוטומטריה המונית שימשה כאן ובעבר⁵ כדי לחקור את הקישור של נוגדן חד שבטי IgG trastuzumab לתחום המסיס של FcRn. דווח כי שני השותפים הקושרים נקשרים בזיקה ננו-מולרית ב-pH¹⁷ חומצי. פוטומטריה המונית שימשה להערכה איכותית של שפע הקומפלקסים שנוצרו בזמן שהשותפים המחייבים היו ב- pH 5.0, והדגימות דוללו במהירות באמצעות מערכת מיקרופלואידית נוספת. ההליך הותאם לאינטראקציה מסוימת בין חלבון לחלבון בהתבסס על תוצאות⁵ שדווחו בעבר. אותו הליך יכול לשמש לחקר אינטראקציות אחרות, בתנאי שלמשתמשים יש ידע מוקדם או לייעל את תנאי הניסוי עבור המערכת המדוברת, כגון באילו מאגרים להשתמש, ריכוז החלבון הראשוני, הסטויכיומטריה הצפויה וכמות הדגירה הדרושה כדי לאפשר לאינטראקציה להגיע לשיווי משקל.

כאשר תערובת IgG-FcRn דוללה ידנית, היה קשה לזהות את נוכחותם של קומפלקסים IgG-FcRn, למרות שחלבונים אלה ידועים באינטראקציה⁵. מאמר זה מראה כי גישת הדילול המהיר מביאה לכמות מוגברת באופן משמעותי של קומפלקסים אלה. עבור אותה מדגם, כאשר נעשה שימוש בדילול מהיר, נצפו בבירור מתחמי FcRn-IgG 1:1 ומתחמי FcRn-IgG 2:1. הבדלים אלה בהיווצרות מורכבת מדגימים את החשיבות של חקר מערכות אינטראקציה ביומולקולריות על פני מגוון רחב של ריכוזים.

בנוסף, תוצאות אלה גם מראות כי זה פשוט להשתמש microfluidics עם ניתוח מולקולה בודדת כדי ללכוד אינטראקציות חלשות – מילוי פער משמעותי בשיטה. השילוב של מיקרופלואידיקה בדילול מהיר עם פוטומטריית מסה מציע יתרונות אטרקטיביים בשל היתרונות של פוטומטריית מסה כטכניקה אנליטית. כלומר, פוטומטריה המונית אינה דורשת תוויות, כרוכה בהכנת מדגם מינימלית, והמדידות נעשות בתמיסה. עבור פרוטוקול זה, יתרון מרכזי נוסף של פוטומטריית מסה הוא היכולת להבחין ולכמת את כל המינים שנוצרו (בתנאי שיש להם מסה ברורה של >30 kDa). זאת בניגוד ל-SPR, למשל, שיכול למדוד קצבי קשירה ואי-קשירה, אך אינו יכול לספק בקלות מידע סטויכיומטריה⁸.

עבור פרוטוקול זה, כמו גם ניסויי פוטומטריה המוניים באופן כללי יותר, מספר שיקולים מועילים. ראשית, ריכוז החלבון הסופי צריך להיות בגבול של מה פוטומטריית מסה יכול למדוד (100 pM-100 nM). ריכוז הדגירה ההתחלתי צריך להיות גם בטווח של המערכת המיקרופלואידית (עד 90 מיקרומטר) ולהיות מעל K_D בפועל של אינטראקציה¹⁰. נקודת המוצא המומלצת היא יחס ערבוב ריכוז של 1:1 בין המינים המקיימים אינטראקציה בריכוז μM. לאחר מכן ניתן היה לשנות את היחס ל-1:2, 1:5, או, כמו במקרה של אינטראקציה זו, ל-1:10. אם אין מידע קודם על אינטראקציות החלבון, המשתמש יצטרך לייעל את הניסוי, החל מריכוז גבוה (מומלץ 20 מיקרומטר) עבור כל שותף כדי לקבוע אם הזיקה של הרכיבים היא בטווח הריכוז שנשמר על ידי השיטה שהוצגה (כלומר, קומפלקסים נוצרים). מיטוב עשוי לכלול גם בחירת תנאי מאגר אחרים כדי לקדם את האינטראקציות או הטיטרציה של אחד מרכיבי האינטראקציה כדי לקבוע את יחס הערבוב הנכון. לאחר קביעתם, ניתן לייעל ריכוזים וזרימות כדי לאפשר תנאים אופטימליים למחקר ולשיטה, למשל, הפחתת הריכוזים כדי לאפשר רזולוציית שיא טובה יותר.

שנית, כדי לשכפל בהצלחה את הניסוי הזה, זיהומים צריך להיות ממוזער. מקורות נפוצים של זיהומים הידועים כמשפיעים לרעה על מדידות פוטומטריה של מסה כוללים חלבונים אחרים או פסולת תאית שנותרת לאחר טיהור, מאגרים לא מסוננים, דטרגנטים יוצרי מיצלה (אם קיימים בריכוז גבוה מדי), ומאגרים המכילים ריכוזים גבוהים של מלח, גליצרול או רכיבים אחרים. כפי שנדון בפרוטוקול לעיל, יש להסיר בועות במערכת המיקרופלואידיקה. בועות יכולות להיווצר במערכת הצינורות או אם הדגימות הן בעלות מתח פנים גבוה ומועדות להיווצרות קצף. בועות יכולות להיווצר גם בשמן הטבילה, אשר ניתן לזהות מטבעת המיקוד (איור 3). אם לא ניתן להסיר בועות באמצעות השלבים המתוארים בפרוטוקול, פתרון נוסף הוא להוציא את הדגימה באמצעות מייבש ומשאבת ואקום, ולהשאיר את הדגימה בלחץ מופחת למשך מספר דקות. ערבול או ניעור תמיסות חלבון מרוכזות מאוד אינו מומלץ מכיוון שפעולות אלה עשויות לקדם היווצרות בועות.

בעוד שמדידה של אינטראקציה ספציפית אחת בין חלבון לחלבון מודגמת כאן, ניתן ליישם את אותו פרוטוקול על מערכות אינטראקציה חלבון-חלבון אחרות ללא שינוי משמעותי. כיוון עתידי נוסף של פרוטוקול זה יהיה להשתמש במדידות כדי לחשב ערכי K_D עבור הקומפלקסים שזוהו, כפי שתואר במקום אחר בהקשר של פוטומטריית מסה ^5,7. בעוד שהמחקרים הקודמים השתמשו בנתונים מניסויים שכללו דילול ידני ואינטראקציות חזקות יותר, עקרון הניתוח יכול להיות מיושם בקלות בהקשר זה – בתנאי שייושמו שיפורים נוספים במכשיר המיקרופלואידי (כגון דיוק מוגבר של חיישן זרימה ויציבות המשאבה).

מעבר לאינטראקציות חלבון-חלבון, סביר להניח שיהיו יישומים רחבים יותר לגישה משולבת של פוטומטריית מסה ומיקרופלואידיקה של דילול מהיר. פוטומטריית מסה יכולה לשמש להערכת טוהר הדגימה, צבירה והומוגניות ^18,19; חקר אוליגומריזציה של חלבונים²⁰, הרכבה מקרומולקולרית²¹ או פילמור²²; ובתחומים אחרים. ניתוח פוטומטריית מסה משתרע גם מעבר לחלבונים; הוא שימש לחקר אינטראקציות בין חומצות גרעין וחלבונים²³, חלקיקים נגיפיים²⁴ וננו-חלקיקים²⁵. פרוטוקול זה מתאר אפוא יישום חשוב של מערכת מיקרופלואידיקה פוטומטרית מסה משולבת – הוא מאפשר מדידה ישירה של אינטראקציות חלבון-חלבון חלשות ברמת מולקולות וקומפלקסים בודדים. הערך של היישום הנוכחי הוא גבוה, שכן הוא פותח את האפשרות לאפיין באופן ישיר אינטראקציות שבדרך כלל היה קשה לחקור – עם רלוונטיות על פני תחומים טיפוליים קריטיים. גישה משולבת זו יכולה לשמש גם בסיס למגוון רחב יותר של חקירות עבור דגימות עם ריכוזים של עד עשרות micromolar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

W.S. נתמך על ידי מלגת מנהיגי העתיד של UKRI [MR/V02213X/1]. הטקסט והגרפיקה של כתב היד הוכנו בתמיכת חברי צוות התקשורת המדעית של רפיין (פנגיוטה פגאנופולו, נויס טורס טמריט, וקתרין ליכטן). אנו מודים גם למשוב רב ערך מקמיל הטז, סופיה פריירה ומתיאס לנגהורסט.

Materials

2-Propanol (Isopropanol)	VWR International LLC	20880.320
Data acquisition software	Refeyn	AcquireMP (v2022 R1)
Data analysis software	Refeyn	DiscoverMP (v2022 R1)
FCRN, His-Tag	Sigma	SRP0624
Herceptin (IgG)	Cambridge Bioscience	HY-P9907-1mg
Mass photometer	Refeyn	TwoMP
Microfluidics box	Refeyn	MassFluidix HC system
Microfluidics chip	Refeyn	MassFluidix HC chip
Microfluidics control software	Fluigent	OxyGEN
Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure	VWR International LLC	K812
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S2770
β-Amylase, from sweet potato	Sigma	A8781

References

Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution. Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).
Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
Li, Z. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386 (2022).
Herling, T. W., et al. A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).
Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).
Wu, D., Piszczek, G. Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784 (2021).
Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
MassFluidix® HC system for rapid dilution via microfluidics. Available from: https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system (2023)
Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, e57264 (2020).
Monnet, C., et al. Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions. Frontiers in Immunology. 6, 39 (2015).
. Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation Available from: https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer (2022)
Lai, S. -. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211 (2021).
Wu, D., Piszczek, G. Standard protocol for mass photometry experiments. European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).
Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure. 6 (1), 63-73 (1998).
Niebling, S., et al. Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288 (2022).
Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry. ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).
Schulz, L., et al. Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos. Science. 378 (6616), 155-160 (2022).
Malay, A. D., et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).
Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization. Science Advances. 8 (35), eabm7935 (2022).
Acharya, A., et al. Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2. Nature Communications. 12, 6521 (2021).
Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 27, 491-501 (2022).
Melo, L., et al. Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Claasen, M., Kofinova, Z., Contino, M., Struwe, W. B. Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry. J. Vis. Exp. (203), e65772, doi:10.3791/65772 (2024).