对实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分

所有用小鼠进行的实验都是根据Unity Health Toronto动物护理委员会批准的动物使用协议进行的，遵循加拿大动物护理委员会制定的指南。确保在整个实验室程序中穿实验室外套、防护手套和眼镜。 1.采集和固定大脑和脊髓 根据机构政策对小鼠实施安乐死。将小鼠俯卧在解剖台上，并使用手术剪刀（向下切割）斩首。 使用Adson镊子（在非惯用手中），抓住鼠标头顶的皮肤。然后用手术剪刀在头顶的皮肤上做一个2.5厘米的切口。 用手指将头部的皮肤横向推动，以可视化下面的颅骨。 通过使用标准 Adson 镊子抓住眼窝来稳定鼠标的头部。 使用细剪刀（惯用手），沿着从颈椎到嗅球的中线在颅骨上剪小剪。注意：一次只在颅骨下方嵌入几毫米的剪刀尖，以避免损坏下面的大脑。 使用带有牙齿的 Adson 镊子横向反射颅骨，以露出下面的大脑。 用非惯用手握住头部。握住剪刀（惯用手），将脊髓从颈椎中挖出，轻轻地将大脑从颅骨中推出，剪断颅神经。 将大脑放入含有 10 mL 10% 中性缓冲福尔马林的锥形管中，该管上标有动物的 ID。 沿着老鼠躯干的中线从脖子到尾巴切开皮毛。 用手指横向推动皮肤以可视化脊柱。 使用手术剪刀，在股骨与髋部连接的水平处向下切开脊柱。 使用手术剪刀从臀部到颈部切割脊柱两侧的体壁。修剪掉任何附着的器官。 将含有脊髓的脊柱放在含有大脑的福尔马林管中。让大脑和脊柱固定 5-7 天。注意：固定的时机很重要。如果组织过度固定，某些抗体将不起作用。如果组织固定不足，则很难在步骤 2 中将脊髓从脊柱中挤出。 2. 脊髓和大脑的粗加工和处理 注意： 以下步骤在通风橱中进行。在开始之前，准备 2 x 10 厘米干净的培养皿、一个装有衬有滤纸的漏斗的锥形瓶、两把手术刀（一把用于切割骨头，一把用于切割中枢神经系统组织）、镜头纸、一支铅笔、嵌入盒和预装有 10% 福尔马林的标本罐。 用剪刀剪下一小块镜头纸（宽度相同，但长度是暗盒的两倍），然后将其放入一个培养皿中。 用铅笔在塑料盒上贴上标本 ID 的标签。 将装有固定大脑和脊柱的管子倒入漏斗中。将脊柱和大脑转移到空的培养皿中。注意：用过的福尔马林将过滤到锥形瓶中，可以在步骤 2.13 中重复使用。 用手术刀将大脑粗略地分成六个冠状体。在小脑尾部切一个，在小脑中间做一个切口，一个小脑在喙部切一个，在剩余的喙脑上切两个，形成 3 个厚度相等的额外冠状切片。 使用镊子，将脑标本转移到培养皿中透镜纸的一半上。 用手术刀将脊髓切成三块：第一个切口在肋骨底部，第二个切口在颈椎曲率下方。 使用相同的手术刀，修剪尾端的骶棘片，直到脊髓可见。 捡起胸椎（非惯用手）。握住 Adson 镊子，牙齿紧闭（惯用手），然后用轻柔的扭转动作轻轻地将镊子的末端推入脊柱的较小开口。脐带应从另一端伸出。注意：任何脊髓大小的圆头器械都可以用于此目的。如果脊髓没有自然弹出，不要强迫它。取而代之的是，用细剪刀沿着脊柱侧面夹住骨头，并将其反射开来，露出脊髓。或者，在福尔马林中将脊髓和大脑固定几天;但是，应将相同的固定时间应用于所有标本，以避免在抗体染色中引入变异性。 拿起标准的Adson镊子（惯用手）。仍然用不太占优势的手握住脊髓片，用镊子轻轻地将出现的脊髓从柱子中拉出。将脊髓片放入装有镜片纸的培养皿中。 对腰/骶和颈柱重复此过程。 使用手术刀将三个脊髓片（颈椎、胸椎、腰椎/骶骨）分成较小的横截面片。切至少 15 段，每段厚度应小于 2 毫米。注意：确保线段短于宽度，这将使截面在步骤 3 的嵌入过程中更容易落在横截面上。 将脊髓片排列在含有脑片的镜片纸的同一半部分。将镜头纸折叠起来，将纸巾夹在中间，然后将其放入贴有标签的暗盒中。注意： 镜头纸可防止小块纸在加工过程中从盒中逸出。 将盒转移到装有回收或新鲜福尔马林的标本罐中。 对剩余的标本重复步骤2.1-2.13。 固定5-7天后，将样品盒从标本容器转移到自动组织处理器中的第一个福尔马林浴中（见 材料表）。根据 补充表1中描述的程序运行组织处理器过夜。将标本保持在温热的石蜡中直至嵌入。 3. 嵌入和切割脑和脊髓切片 将盒从处理器转移到石蜡包埋站的温室（参见 材料表）。 将每只小鼠的脊髓和脑横截面嵌入单个石蜡块中，如下所示（图1）：首先，倒入石蜡以覆盖模具底部。使用细镊子，将脑冠状动脉和脊髓横截面片放入模具底部的石蜡中。 将模具转移到冷却表面几秒钟，以将大脑和脊髓部件固定到位。将模具移回加热表面，并用热石蜡填充到顶部。 将盒盖（标有样品 ID）放在模具顶部。将更多的石蜡倒在盒盖上。将模具转移到冷却站，让蜡凝固（冷却 30-60 分钟）。注意：嵌入脊髓切片需要练习。为了提高成功率，请使用较短的脊髓长度（<2 毫米），因为这些脊髓更有可能落在横截面上。可以佩戴外科放大镜以帮助区分脊髓碎片是否横截面。 将石蜡块安装在旋转切片机上。修剪块，直到感兴趣的组织出现在石蜡切片中。 切下每个块的5μM条带，并将它们转移到42°C水浴中。 收集载玻片上的部分，并将载玻片放在载玻片架中。 在37°C的干燥烤箱中烘烤切片过夜。在进行染色之前冷却载玻片。 4. 切片的脱蜡和复水，准备染色 注意： 步骤在通风橱中执行。在开始之前，准备溶剂浴。制备5L的1x PBS（1L ddH 2O，8g NaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4,0.24g KH2PO4;pH = 7.4）与0.05%吐温-20（PBS-T）用于所有洗涤步骤。 通过将载玻片置于振荡器上连续两个二甲苯或非二甲苯基溶剂浴中5分钟，并轻轻搅拌，进行脱蜡。 通过将载玻片转移通过连续的乙醇百分比下降的浴液来补充组织水分：2×100%乙醇（每个5分钟），2×95%乙醇（每个3分钟）和1×70%乙醇（3分钟）。保持在 95% 乙醇中用于 LFB 染色，并重新水化至 70% 乙醇，并保持在 PBS-T 中用于免疫组织化学 （IHC）。 5. 髓鞘与 H&E 的 LFB 制备0.1%LFB（0.2g LFB，参见 材料表，200mL 95%乙醇，0.5mL冰醋酸）的溶液。混合并过滤到锥形瓶中。 存放在深色瓶子中直至使用。 将切片从95%乙醇转移到玻璃载玻片架中，该载玻片架放置在含有LFB的染色皿中。盖上盘子并用石蜡膜密封以防止蒸发。 将切片在56°C烘箱中孵育过夜（最多16小时）。 第二天早上，将载玻片转移到ddH2O浴中并保持。 同时，配制（1）新鲜的0.05%碳酸锂溶液（0.05g碳酸锂，100mL ddH2O）;（2）曙红Y溶液（在40mL ddH20中加入2g曙红盐，混合至溶解，然后与160mL 95%乙醇混合）。准备以下浴液：1 x 碳酸锂，3 x 70%乙醇，3 x 95%乙醇，2 x 100%乙醇，3 x ddH20。按使用顺序放置浴槽（见 附表2）。 按照 补充表 2 中概述的步骤操作。 载玻片干燥后，在显微镜下观察脱髓鞘病变。 6. 无 H&E 的髓鞘 LFB 执行此染色程序以分析髓鞘。注意：该过程与步骤 5 相同（参见 补充表 2），但工作流程有所简化。在步骤 4 之后，继续从步骤 10 开始的过程。 7. 免疫组织化学 （IHC） 染色的抗原修复和过氧化物酶淬灭 注意：在开始之前，在通风橱中制备 100 mL 过氧化氢的甲醇溶液（1 份 30% 过氧化氢溶液在 9 份 100% 甲醇中）。用吐温-20（2.94g柠檬酸三钠，溶解在搅拌板上的烧杯中的1L ddH20中，使pH至6.0，并加入500μl吐温-20）制备1L 10mM柠檬酸盐缓冲液。准备 PBS-T（参见步骤 4）。除非另有说明，否则所有洗涤均在PBS-T浴中轻轻搅拌（在振荡器上）进行。 通过将载玻片置于甲醇中的3%过氧化氢中15分钟（在通风橱中）来淬灭内源性过氧化物酶。在PBS-T中洗涤载玻片两次（每次2分钟）。 将载玻片转移到金属载玻片支架上，并放入高压锅中的1L柠檬酸盐缓冲液中。密封盖子并在蒸汽排放口顶部添加橡胶塞。 在微波炉中高温烹饪，直到压力锅上的黄色标签弹出，表示已达到最大压力。在最大压力下再煮 5 分钟，然后戴上防护手套从微波炉中取出压力锅。 通过取下塞子来减压。 取下盖子，让载玻片在柠檬酸盐缓冲液中冷却20分钟，然后继续进行所需的染色方法。注意： 释放蒸汽时向后站，因为它会导致烫伤。 8. CD45免疫组化 注意：这种 IHC 方法用于可视化浸润的白细胞。亲和素/生物素封闭步骤与封闭和一抗孵育步骤相结合。 准备封闭缓冲液（2%BSA，2%兔血清，溶于1x PBS）。 将载玻片转移到载玻片托盘上，并用PBS-T洗涤两次（每次2分钟）。制备亲和素/封闭溶液（4滴/mL亲和素在2%BSA / 2%兔血清中，溶于1 x PBS中，参见 材料表）。 使用实验室纸巾擦干组织周围多余的PBS-T。使用疏水笔，在组织周围画一个圆圈，然后将载玻片放入潮湿的室内。 将亲和素/封闭溶液涂抹在每个切片上（400μL/载玻片）。 盖上湿润的腔室，在室温下孵育30分钟。 在此步骤中，在含有生物素（4滴/ mL生物素，2%BSA / 2%兔血清的1x PBS溶液）的封闭缓冲液中制备抗CD45抗体（补充表3）。 将阻塞溶液从滑块上滑到无绒实验室擦拭布上。使用实验室湿巾轻拍组织以去除多余的液体。 将载玻片放回潮湿的腔室中。在切片上加入 400 μL CD45 抗体溶液（参见 材料表）。在有盖的潮湿室中以4°C孵育过夜。 第二天，排出一抗并在PBS-T中洗涤载玻片3次（每次5分钟）。 使用无绒实验室干燥切片周围的区域，然后在每个切片上加入 400 μL 二抗（在封闭缓冲液中以 1：200 稀释度）。在室温下孵育1小时。 同时，通过将 2 滴试剂 A 加入 5 mL 1x PBS 中并混合来制备 ABC 试剂（参见 材料表）。将 2 滴试剂 B 加入同一溶液中并混合（使用前准备 ~30 分钟）。 用1x PBS-T（每次5分钟）的3次更换洗涤载玻片，并将载玻片置于潮湿的室内。 向切片中加入 400 μL ABC 试剂。盖上湿润的腔室，在室温下孵育30分钟。 用1x PBS-T（每次5分钟）洗涤载玻片3次。同时，根据制造商的说明，在铝箔覆盖的 15 mL 离心管中制备适量的 DAB 溶液（见 材料表）。 取一张载玻片，在显微镜下聚焦于脊髓切片。向载玻片中加入 400 μL DAB 并启动实验室计时器。 在切片发育时可视化切片，并在白细胞呈棕色时停止计时器。将载玻片转移到ddH20浴中以停止反应。在水中保持5分钟。其余幻灯片使用相同的显影时间。注意：DAB是一种致癌物。将 DAB 废物和 DAB 后的 ddH2O 作为危险废物处理。 用Mayer’s苏木精复染载玻片~4-10分钟（见 补充表2）。用流动的自来水冲洗载玻片 10 分钟。 在95%乙醇中脱水（1×3分钟），然后用无水100%乙醇（每次2×3分钟）。 移入通风橱，将载玻片转移到二甲苯或二甲苯替代溶剂中5分钟。盖玻片与安装介质，让载玻片在通风橱中干燥 1-2 天。注意： 如果使用二甲苯，请在盖子滑落时使用双层手套和镊子处理载玻片，因为它有毒并且会溶解手套。 使用二甲苯清洁载玻片，并使用载玻片扫描仪以 20 倍放大倍率进行扫描。 9. SMI-32 IHC治疗轴突损伤 注意：该方案使用小鼠SMI-32抗体，其对非磷酸化的神经丝重度发生反应，该神经丝可以积聚在受伤的轴突25中。由于该抗体已在小鼠中产生并可检测小鼠抗原，因此建议使用小鼠对小鼠 （MOM） 试剂盒。在此过程中，亲和素/生物素阻断步骤作为与一抗孵育分开的步骤进行。 在开始该方案之前，如步骤4和步骤7所述，脱蜡，再水化，淬灭内源性过氧化物酶活性并进行抗原修复。 用 2 x PBS-T（每次 2 分钟）洗涤切片两次。使用实验室纸巾去除切片周围多余的液体，并使用疏水笔在组织周围画一个圆圈。 向切片中加入 400 μL 封闭缓冲液（2% （w/v） 山羊血清，溶于 1x PBS-T 中）和亲和素（4 滴/mL）。在室温下孵育15分钟。 将载玻片浸入 1x PBS-T 中两次。向载玻片中加入 400 μL 含有生物素（4 滴/mL）的封闭缓冲液，并在室温下孵育 15 分钟。 在1×PBS-T浴中洗涤载玻片2分钟。同时，通过向 2.5 mL 的 1x PBS 中加入 2 滴储备溶液（参见 材料表）来制备 MOM 封闭试剂。 向切片上加入 400 μL MOM 试剂。在室温下孵育1小时。 在 1x PBS-T 浴中洗涤载玻片两次 2 分钟。同时，通过将 300 μL 浓缩蛋白储备液加入 3.75 mL 1x PBS 中来制备 MOM 稀释剂。 加入 400 μL MOM 稀释剂，并在室温下孵育 5 分钟。同时稀释MOM稀释剂中的SMI-32抗体（见 材料表）。 从载玻片中取出稀释剂，并在切片上加入 400 μL SMI-32 抗体溶液。盖上湿润的腔室，在室温下孵育30分钟。 在1x PBS-T浴中洗涤载玻片两次2分钟，每次轻轻搅拌。同时，在稀释剂中稀释MOM抗小鼠IgG工作试剂（10μL原液在2.5mL稀释剂中）。 每载玻片加入 400 μL 抗小鼠 IgG 工作试剂。孵育 10 分钟。 在1x PBS-T浴中洗涤载玻片两次，每次2分钟。按照CD45染色方案中概述的步骤继续染色（步骤8.11 – 8.19）。 10. 脱髓鞘病变的 LFB 和 H&E 评分 注意：以下是一种分析方法，可用于快速了解炎症性脱髓鞘的严重程度。该分析在不同水平（颈椎、胸椎和腰椎，每个水平至少 3 个部分）采样的脊髓部分进行。请参阅 Allen Brain Atlas for Mouse spinal cord26 ，以帮助确定脊髓的解剖水平。此分析需要 TIFF 文件。如果扫描的图像为 .czi 格式，请按照 补充表 4 中的说明将 czi 文件转换为 TIFF 文件。 通过将文件拖放到 ImageJ 中，打开要分析的部分的 TIFF 图像。观察 4 个象限的脊髓切片：背侧、左外侧、右外侧和前侧（图 2A、B）。 如 图 2 所示，每个象限中是否存在脱髓鞘病变的评分。注意：病变的存在导致该象限的得分为 1，每个部分总共有 4 个可能的分数。即使象限内有多个病变，也会分配 1 分。 将每只小鼠的所有点相加，然后除以采样的象限总数，以获得具有脑膜下病变的象限的比例。 11.计算脊髓白质中LFB染色的面积分数 注意：该分析测量用 LFB 染色的脊髓白质的面积百分比。 通过将文件拖放到 ImageJ 中，打开另存为 TIFF 文件的 LFB 染色部分。 单击“图像>键入 > 8 位以生成灰度图像。单击图像>调整>阈值。调整底部滑块，使红色覆盖层捕获肉眼看到的所有黑暗区域（髓鞘）（图2C-E）。单击“应用”。 单击 Analyze > Tools > ROI Manager 以打开 ROI 管理器。 在 ImageJ 工具栏上选择 多边形 绘图工具。这个绘图工具允许人们用电脑鼠标勾勒出脊髓区域。 勾勒出脊髓的背侧区域，然后单击键盘上的 t 将多边形添加到 ROI 管理器中。 勾勒出脊髓白质的前外侧区域，并将多边形添加到 ROI 管理器中。注意：追踪时，排除大血管、组织撕裂、伪影和背角附近区域（图 2A、B 箭头），这些区域通常髓鞘较少。跟踪时要尽可能准确，因为包含过多的白色背景会使结果出现偏差。 单击 “分析>集测量 ”，然后选择 “面积分数”。 单击 ROI 管理器中的“测量 ”。这将给出用 LFB 染色的轮廓区域的比例。 从新生成的结果框中，将值复制到 Excel 中，然后关闭图像窗口。计算背侧和腹外侧区域染色的平均百分比分数面积。对这些数字进行平均，以获得该部分的值。 对颈椎、胸椎和腰椎切片重复步骤 11.1–11.9（N = 3/水平/小鼠）。 计算每只小鼠所有部分的平均髓鞘分数百分比。脱髓鞘百分比是通过从 100 中减去面积染色百分比来估计的。 12. CD45+ 细胞和SMI-32+ 轴突卵形数分析 将 CD45 或 SMI-32 染色的 TIFF 图像拖放到 ImageJ 中。单击 “分析>设置比例”>“全局>确定 ”以在所有图像中设置比例尺。请注意，这仅针对第一个图像执行。 选择 多边形 绘图工具，并使用计算机鼠标在灰质周围进行描摹。单击 “分析>测量 ”并将结果记录在Excel中为“灰质区域”。 在绘制的多边形仍在图像上的情况下，通过单击 Delete 键（键盘）从图像中删除灰质。这个动作只留下白质进行分析。 使用 多边形 绘图工具勾勒出整个脊髓切片的轮廓。排除任何缺失或受损的组织区域。 单击 “分析>测量 ”，并将结果记录为“总组织面积”，并记录在Excel文件中。 单击 “图像>颜色”>“颜色反卷积”。从矢量下拉窗口中，选择 H DAB。将出现三个新窗口 – 保留棕色色调的窗口（DAB 通道）并删除其他图像窗口。 单击 图像>调整>阈值。调整底部滑块以阈值化图像，以便红色叠加层捕获与肉眼检测到的相同数量的棕色染色。单击 “应用”。 单击 Process > Binary > Watershed。在此步骤中，比较原始图像和二进制图像以确保它们一致。 单击 “分析”>“分析粒子”。 选择 “显示叠加 ”并修改设置：尺寸 = 5 – 150 μm2，圆度 = 0.4 – 1。单击 “确定”。注： 这些设置允许将未使用分水岭函数拆分的单个像元和一小组像元包括在内，而不是在分析中排除。 在结果窗口中，记录 Excel 最左边列中的最后一个数字，该数字表示总粒子计数。然后，计算白质面积（总组织面积 – 灰质面积，单位为mm 2）。表示每个白质区域的总颗粒计数（计数/mm2）。 对每个保存的 RGB 图像重复步骤。一旦分析了一只小鼠的所有脊髓切片，就平均该小鼠每 mm2 组织的颗粒计数。注意：用于分析脊髓白细胞的工作流程也可以应用于大脑区域。 13. 使用SIMOA测定法测量sNF-L 使用毛细血管微管通过隐静脉出 血或使用 注射器和 25 G 针头通过心脏穿刺（终末手术）从活小鼠收集 100–200 μL 血液。对于后者，将血液转移到 1.5 mL 微量离心管中。 让血液在室温下凝结 30-60 分钟。 在4°C下以2660× g 离心样品5分钟，并将上部馏分（血清）移液到新的微量离心管中。将血清储存在-80°C直至准备使用。 制备：使用前将校准品和对照品（NF-光测定试剂盒，参见 材料表）加热至室温1小时。 将酶底物（RGP）从冰箱中取出，置于30°C水浴中至少30分钟，每10分钟涡旋一次。 将血清样品在冰上解冻。解冻后，轻轻涡旋样品并以10000× g 离心5分钟以沉淀任何碎片。 加载板：涡旋校准器和控制器。将校准品一式两份，对照品一式两份，血清样品一式两份加载到试剂盒随附的 96 孔板上。血清样品以1：3的比例稀释，稀释剂在试剂盒中提供。 密封板。 按照计算机、程序和机器的顺序打开 SIMOA 机器（参见 材料表）。允许计算机初始化并运行 “开始一天的 维护”。 涡旋磁珠30秒。 屏幕上的“加载试剂”选项卡，双击要放置试剂瓶的架子位置，然后扫描试剂瓶的条形码。 将磁珠置于架子上的摇晃位置（位置 1-3）。 继续，将检测器、SBG 试剂和 RGP 试剂装入机器中。 单击软件上的 设置 。确保样品模式在板上。在“设置运行”选项卡中，为试验命名。 在板上为校准品分配孔，如下所示：单击孔，然后选择检测方法。选择 校准 A ，然后单击 升序。突出显示孔 A1-8，然后单击 重复 （2） 以分配要重复运行的校准器的坐标。使用简洁的协议运行。注意：请参阅分析证书（制造商网站）以获取每个特定批号的每个校准品的浓度。一旦分配了孔，就不可能在不丢失工作的情况下离开此屏幕，直到板锁定到位。 按照以下步骤分配示例：在屏幕的右下角，单击 按钮 以分配样本。突出显示样品所在的孔。 从列表中勾选要运行的检测，选择重复次数，并指定 4 倍的板载稀释度。 在孔仍突出显示的情况下，输入样品 ID 和起始编号的前缀，然后单击 “生成 ”以生成样品的顺序 ID。对照样品重复步骤。 将板装入板架（A1 至 A12）。 在屏幕界面上，单击 “完成编程示例 ”，然后进入“系统资源”选项卡。检查所有试剂容器是否已满，废物容器是否为空。 单击 “运行”。 运行完成后，通过选择测定和板名称来检查“数据缩减”选项卡下的校准曲线。 转到“运行历史记录”并使用过滤器查找最近的运行。选择 “运行 ”，然后选择 “所有结果”。单击 导出，然后保存.csv文件。单击“报告 ”，然后选择 “批量校准报告 ”，然后选择最近的运行。预览报表并将其导出。 运行制造商建议的日终维护。关闭程序、本机，然后关闭计算机。