Her beskriver vi protokoller for den biofysiske karakterisering af ternær kompleks dannelse induceret af proteolyse rettet mod kimærer (PROTACS), der involverer ubiquitin ligaserne Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) og Cereblon (CRBN). Biofysiske metoder illustreret heri omfatter overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC).
E3-ligaser og proteiner, der er målrettet mod nedbrydning, kan induceres til dannelse af komplekser af heterobifunktionelle molekyler i en flertrinsproces. Kinetikken og termodynamikken af de involverede interaktioner bidrager til effektiviteten af ubiquitination og deraf følgende nedbrydning af proteinet. Biofysiske teknikker såsom overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) giver værdifuld information, der kan bruges til optimering af disse interaktioner. Ved hjælp af to modelsystemer blev der etableret et biofysisk assayværktøjssæt til forståelse af kooperativiteten af ternær kompleks dannelse og virkningen af ‘krogeffekten’ på bindingskinetikken. I et tilfælde blev et proteolyse rettet mod kimær (PROTAC) molekyle, der inducerede ternær kompleks dannelse mellem Brd4BD2 og VHL, evalueret. Det heterobifunktionelle molekyle, MZ1, har nM-affiniteter for både Brd4BD2-proteinet (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) og VHL-komplekset (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). Til dette system blev der udviklet robuste SPR-, BLI- og ITC-assays, der gengav offentliggjorte resultater, der demonstrerede samarbejdsevnen af ternær kompleks dannelse. I det andet tilfælde blev et molekyle, der inducerede ternære komplekser mellem et 46,0 kDa-protein, PPM1D og cereblon [CRBN (319-442)] undersøgt. Det heterobifunktionelle molekyle, BRD-5110, har en SPR K D = 1 nM for PPM1D, men meget svagere binding mod det afkortede CRBN (319-442) kompleks (SPR KD = ~ 3 μM). I dette tilfælde var bindingen for CRBN i SPR ikke mættet, hvilket resulterede i en “krogeffekt”. Krav til gennemløb og reagens for SPR, BLI og ITC blev evalueret, og der blev givet generelle anbefalinger til deres anvendelse på PROTAC-projekter.
Polyubiquitinering af proteiner i cellen er en stramt reguleret proces, der involverer enzymer i Ubiquitin Ligase-familien 1,2. De terminale enzymer i vejen er E3 ubiquitin ligaser, der kovalent binder ubiquitinmolekyler til deres proteinbindende partnere3. Polyubiquitinationen af disse proteinbindende partnere er rettet mod dem til proteolytisk nedbrydning af proteasomet4. Dette system er en del af proteinhomeostaseprocessen, der er blevet terapeutisk udnyttet til at fremkalde nedbrydning af proteiner involveret i sygdom5. Små molekyler, der inducerer interaktionen mellem E3 ubiquitinligaser, såsom Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) eller cereblon (CRBN), består typisk af et E3-ligasebindende sprænghoved forbundet med en fleksibel linker til et sprænghoved, der binder til proteinet, der er målrettet mod nedbrydning. Disse heterobifunktionelle molekyler kaldes almindeligvis proteolyse rettet mod kimærer eller PROTACS6.
Udviklingen af PROTACS indebærer evaluering af molekylers evne til at inducere nedbrydning af proteiner i celler. Mange cellulære analysesystemer er blevet udviklet, der overvåger den inducerede interaktion mellem målproteinet og E3-ligasekomponenterne, såsom VHL eller CRBN, efter behandling af cellerne med et PROTAC-molekyle. Et sådant cellulært assay, nanoluc-Halotag-systemet7, involverer en E3-ligase fusioneret til Halotag-acceptoren og et målprotein mærket med en nanoluc-donor. Ternær kompleks dannelse bringer nanolucdonoren og Halotag-acceptoren i nærhed, hvilket muliggør overførsel af energi fra donoren til acceptoren, hvilket resulterer i udsendelse af lys. Variationer af dette system kan bruges til at vurdere den cellulære permeabilitet af PROTACS-molekyler8 eller ændringer i det relative niveau af målproteinubiquitination9. Mens disse cellulære systemer er afgørende for at drive optimeringen af PROTACS, er dannelsen af komplekser mellem E3-ligaser og proteiner, der er målrettet mod nedbrydning, en flertrinsproces10,11. Kinetikken og termodynamikken i de involverede binære og ternære interaktioner bidrager til effektivitet, ubiquitination og deraf følgende nedbrydning af proteinet12,13,14.
Heri beskrives protokoller, der kan tilpasses til den biofysiske karakterisering af ternær kompleks dannelse induceret af PROTACS ved anvendelse af overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). SPR- og ITC-protokoller for MZ1 PROTAC-molekylet, der inducerer ternær kompleks dannelse mellem Brd4BD2 og VHL afledt af litteraturrapporter13,15 og beskrevet her, var i stand til at rekapitulere de rapporterede resultater med en vis ændring af de rapporterede procedurer, som vil blive diskuteret. En beskrivelse af et BLI-assay, der anvendes til at evaluere ternær kompleks dannelse mellem MZI, Brd4BD2 og VHL, er inkluderet i denne rapport. Affinitetsmålinger fra BLI var konsistente med dem, der blev observeret i SPR og ITC. En tidligere offentliggjort protokol, hvori der blev udviklet et SPR-assay til vurdering af den PROTAC-inducerede ternære komplekse dannelse mellem PPM1D, en Ser/Thr-proteinphosphatase, hvis ekspression induceres på en p53-afhængig måde16, og CRBN, beskrives også. I dette tilfælde har PROTAC-molekylet en nanomolær affinitet for PPM1D, men kun en mikromolær affinitet for CRBN. I dette tilfælde er bindingen af PROTAC-molekylet til CRBN ikke mættet, hvilket resulterer i den almindeligt observerede “krogeffekt”. Krogeffekten er en egenskab ved tre kropssystemer, hvor der er to arter, der kan danne et heterotrimerisk kompleks, når begge er bundet til et bromolekyle (figur 1)17. Krogeffekten observeres, når brobygningsarten er i overskydende koncentration i forhold til de to andre arter. Den resulterende tilstand er en, hvor de binære interaktioner udkonkurrerer de ternære interaktioner. De systemer, hvor krogeffekten observeres, kræver specifikke eksperimentelle designovervejelser, der diskuteres i denne rapport. Generelle begreber og reagenskrav til evaluering af anvendelsen af biofysiske assays til evaluering af PROTAC-induceret ternær kompleks dannelse er tilvejebragt.
Biofysisk karakterisering af de binære og ternære interaktioner mellem PROTAC-molekyler og deres proteinbindende partnere kan give unik og komplementær indsigt i forhold til udbredte cellulære systemer. Forståelse af affiniteten mellem hvert sprænghoved af et PROTAC-molekyle og dets proteinbindende partnere kan hjælpe med at guide medicinalkemiske bestræbelser mod optimering af disse interaktioner. Tidligere publicerede krystalstrukturer af ternære PROTAC-komplekser har afsløret, at atomer i linkerregionen kan …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en innovations- og teknologiudviklingspris fra Center for udvikling af terapi ved Broad Institute of MIT og Harvard. Forfatterne ønsker at takke medlemmerne af den øverste ledelse og bedømmelsesudvalget for deres støtte til dette arbejde.
96-plate | Greiner | 655076 | flat-bottom, black plates used In BLI experiments |
96-well plate | Nunc | 73520-120 | Plate use for ITC sample preparation |
96-well plate | Greiner | 650101 | Plate used to prepare samples for SPR experiments |
Auto iTC200 micro-calorimeter | Malvern Panalytical | Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued. | |
Biacore S200 | Cytiva | 29136649 | Instrument used to perform SPR experiments |
MZ1 | ProbeChem | PC-60099 | PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2 |
NTA sensor chip | Cytiva | BR100532 | SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D |
Octet Red-384 | Sartorius | Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued. | |
Plate cover | Malvern | PQA0001 | Cover for Nunc 96-well plate (73520-120) |
Plate cover | Cytiva | 28975816 | Plate cover for Greiner plate (650101) |
Series S SA sensor chip | Cytiva | BR100531 | SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4 |
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors | Sartorius | 18-509 | Coated sensors used in BLI experiments |