Metabolômica direcionada em células primárias raras

O metabolismo é um processo biológico essencial que ocorre em todas as células vivas. Os processos metabólicos envolvem uma vasta rede de reações bioquímicas que são fortemente reguladas e interligadas, permitindo que as células produzam energia e sintetizem biomoléculas essenciais¹. Para entender a função das redes metabólicas, os pesquisadores medem os níveis de pequenas moléculas intermediárias dentro das células. Esses intermediários servem como importantes indicadores da atividade metabólica e podem revelar insights críticos sobre a função celular.

A espectrometria de massas (EM) é a escolha mais popular para a detecção específica de metabólitos em amostras complexas ^1,2. A ressonância magnética nuclear (RMN) tem vantagens na quantificação absoluta de compostos e na elucidação da estrutura, mas a EM pode frequentemente resolver mais componentes em misturas complexas, como biofluidos ou extratos celulares. Na maioria das vezes, a EM é combinada com a separação prévia do composto por eletroforese capilar (CE), cromatografia gasosa (GC) ou cromatografia líquida (LC)³. A escolha da plataforma de separação é impulsionada principalmente pela gama de metabólitos alvo e pelo tipo de amostra e, em um cenário do mundo real, pela disponibilidade de máquinas e experiência. Todas as três plataformas de separação têm uma ampla e sobreposta gama de metabólitos adequados, mas limitações diferentes. Resumidamente, a CE só pode separar moléculas carregadas e requer muita experiência para implementar análises robustas de um grande número de amostras⁴. O CG é limitado a moléculas pequenas e apolares o suficiente para evaporar antes de se decomporem³. Considerando todas as colunas LC disponíveis comercialmente, quaisquer dois metabólitos podem ser separados por essa tecnologia⁵. No entanto, muitos métodos LC exibem menor poder de resolução do que os métodos CE ou GC de comprimento semelhante.

A quantidade típica de material de partida para medições metabolômicas está geralmente na faixa de 5 x 10⁵ a 5 x 10⁷ células por amostra, 5-50 mg de tecido úmido ou 5-50 μL de fluido corporal⁶. No entanto, pode ser um desafio obter tais quantidades de material de partida ao trabalhar com células primárias de tipos celulares raros, como, por exemplo, células-tronco hematopoéticas (CTHs) ou células tumorais circulantes. Essas células estão frequentemente presentes em números muito baixos e não podem ser cultivadas sem comprometer características celulares críticas.

As CTHs e as células progenitoras multipotentes (MPPs) são as células menos diferenciadas do sistema hematopoiético e produzem continuamente novas células sanguíneas ao longo da vida de um organismo. A regulação da hematopoese é de relevância clínica em condições como leucemia e anemia. Apesar de sua importância, as CTHs e MPPs estão entre as células mais raras do sistema hematopoético. De um único camundongo, tipicamente, cerca de 5000 CTHs podem ser isoladas ^7,8,9. Como os métodos metabolômicos tradicionais requerem mais material de entrada, o agrupamento de células de múltiplos camundongos foi frequentemente necessário para analisar tipos celulares raros^10,11.

Aqui, nosso objetivo foi desenvolver um protocolo que possibilitasse a mensuração de metabólitos em até 5000 células por amostra para possibilitar a geração de dados metabolômicos a partir das CTHs de um único^camundongo12. Ao mesmo tempo, este método permite gerar múltiplas réplicas a partir de um único rato para tipos celulares mais abundantes, como os linfócitos. Esta abordagem reduz o número de animais necessários para um determinado projeto, contribuindo assim para o “3R” (redução, substituição, refinamento) de experimentos com animais.

Metabólitos em células podem ter taxas de turnover muito altas, muitas vezes da ordem de segundos¹³. No entanto, o preparo de amostras para a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) pode levar horas, e a própria classificação da FACS pode levar de minutos a horas, levando a possíveis alterações no metaboloma devido a condições não fisiológicas. Alguns dos reagentes usados neste protocolo (como tampão de lise amônio-cloreto de potássio [ACK]) podem ter efeitos semelhantes. Essas condições podem causar estresse celular e afetar os níveis e proporções de metabólitos dentro das células, levando a medidas imprecisas ou enviesadas do metabolismo celular 14,15,16. As alterações metabólicas devidas à preparação da amostra são por vezes referidas como artefatos de triagem. Longos protocolos de digestão e reagentes severos que podem ser necessários para produzir suspensões unicelulares a partir de tecidos duros ou resistentes podem agravar esse problema. As mudanças que podem ocorrer provavelmente dependem do tipo de célula e da condição de processamento. A natureza precisa das alterações permanece desconhecida, uma vez que o estado metabólico das células não perturbadas no tecido vivo não pode ser medido.

O protocolo aqui apresentado envolve várias diferenças importantes em relação aos métodos tradicionais, a saber, o uso de NaCl 5 g/L como fluido de bainha, a classificação diretamente em tampão de extração, a injeção de grandes volumes de amostra em cromatografia líquida-espectrometria de massas de interação hidrofílica (HILIC-MS), e a utilização de quantificação direcionada, uso rigoroso de padrões internos e controles de fundo (Figura 1). Esse protocolo tem o potencial de preservar diferenças entre os tipos celulares e entre o tratamento medicamentoso e o controle do veículo em grande medida¹². Mesmo para células cultivadas, compara-se favoravelmente a abordagens alternativas, como a centrifugação mais estabelecida e a remoção manual do sobrenadante. No entanto, como os artefatos de classificação ainda podem ocorrer, os dados devem ser interpretados com cautela. Apesar dessa limitação, o protocolo representa uma melhora significativa no campo do perfil metabólico, permitindo medidas mais precisas e abrangentes do metabolismo celular em células primárias^raras12.

A capacidade de medir de forma robusta perfis metabólicos amplos em células primárias raras abre as portas para novos experimentos em pesquisas biomédicas envolvendo essas células. Por exemplo, foi demonstrado que a regulação metabolicamente mediada em HSCs afeta a capacidade de autorrenovação da dormência, com implicações para anemia e leucemia ^11,17. Em células tumorais circulantes derivadas do paciente, diferenças na expressão de genes metabólicos entre células tumorais e adjacentes têm sido demonstradas^18,19. Esse protocolo agora permite que os pesquisadores estudem essas diferenças sistematicamente em um nível metabólico, que geralmente é considerado mais próximo do fenótipo celular do que da expressão gênica.