Псевдотипированные вирусы как молекулярный инструмент мониторинга гуморальных иммунных реакций против SARS-CoV-2 с помощью нейтрализационного анализа
Summary
Псевдотипированные вирусы (ЛВ) представляют собой вирионы с дефектами репликации, которые используются для изучения взаимодействий между хозяином и вирусом в более безопасных условиях, чем при работе с подлинными вирусами. Здесь представлен подробный протокол, показывающий, как ПВ SARS-CoV-2 можно использовать для проверки нейтрализующей способности сыворотки крови пациентов после вакцинации против COVID-19.
Abstract
Псевдотипированные вирусы (ЛВ) представляют собой молекулярные инструменты, которые могут быть использованы для изучения взаимодействий между вирусом хозяина и для проверки нейтрализующей способности образцов сыворотки, в дополнение к их более известному использованию в генной терапии для доставки интересующего гена. ФВ являются дефектными для репликации, потому что вирусный геном разделен на различные плазмиды, которые не включены в ФВ. Эта безопасная и универсальная система позволяет использовать фотоэлектрические элементы в лабораториях 2-го уровня биобезопасности. Здесь мы представляем общую методологию получения лентивирусных ВП на основе трех плазмид, упомянутых здесь: (1) основная плазмида, несущая репортерный ген, необходимый для мониторинга инфекции; (2) упаковочная плазмида, несущая гены всех структурных белков, необходимых для генерации PV; (3) плазмида экспрессии гликопротеина на поверхности оболочки, которая определяет тропизм вируса и опосредует проникновение вируса в клетку-хозяина. В этой работе SARS-CoV-2 Spike представляет собой гликопротеин оболочки, используемый для производства нерепликативных псевдотипированных лентивирусов SARS-CoV-2.
Вкратце, упаковочные клетки (HEK293T) были котрансфицированы тремя различными плазмидами с использованием стандартных методов. Через 48 ч надосадочную жидкость, содержащую PV, собирали, фильтровали и хранили при -80 °C. Инфекционность ВВ SARS-CoV-2 проверяли путем изучения экспрессии репортерного гена (люциферазы) в клеточной линии-мишени через 48 ч после заражения. Чем выше значение единиц относительной люминесценции (RLU), тем выше частота заражения/трансдукции. Кроме того, к последовательно разбавленным образцам сыворотки крови добавляли инфекционные ФВ для изучения процесса нейтрализации проникновения псевдовирусов в клетки-мишени, измеряемого как снижение интенсивности РЛУ: более низкие значения, соответствующие высокой нейтрализующей активности.
Introduction
Псевдотипированные вирусы (ФВ) — это молекулярные инструменты, используемые в микробиологии для изучения взаимодействий вируса-хозяина и патоген-патоген 1,2,3,4. PV состоят из внутренней части, вирусного ядра, которое защищает вирусный геном, и внешней части, гликопротеинов оболочки на поверхности вируса, которые определяюттропизм. Псевдовирус неспособен к репликации в клетке-мишени, потому что он не содержит всей генетической информации для генерации новых вирусных частиц. Такое сочетание специфических особенностей делает PV безопасной альтернативой вирусу дикого типа. Вирусы дикого типа, с другой стороны, высокопатогенны и не могут быть использованы в лабораториях BSL 2 для анализа6.
Инфекционность ФВ может контролироваться репортерным геном, обычно кодирующим флуоресцентный белок (GFP, RFP, YFP) или фермент, продуцирующий хемилюминесцентные продукты (люциферазу). Он содержится в одной из плазмид, используемых для производства ФВ, и включен в геном псевдовируса7.
В настоящее время существует несколько типов фотоэлектрических ядер, в том числе лентивиральные частицы, основанные на геноме ВИЧ-1. Большим преимуществом ПВ на основе ВИЧ-1 перед другими платформами является их внутренний процесс интеграции в геном клетки-мишени8. Несмотря на то, что ВИЧ-1 является высококонтагиозным вирусом и возбудителем СПИДа, эти лентивирусные векторы безопасны для использования благодаря обширным этапам оптимизации, которые были предприняты на протяжении многих лет. Оптимальные условия безопасности были достигнуты при введении 2-х лентивирусных векторовnd-го поколения, в которых вирусные гены истощались без влияния на трансдукционные возможности9. 3-е и4-е поколения способствовали повышению безопасности работы с лентивирусным вектором с дальнейшим расщеплением вирусного генома на отдельные плазмиды10,11. Последние поколения ФВ, как правило, используются для производства лентивирусных векторов для генной терапии.
PV могут быть использованы для изучения взаимодействия между вирусами и клетками хозяина, как на этапе производства, так и на этапе заражения. ФВ особенно используются в анализах на нейтрализацию псевдовирусов (ПВНК). ПВНК широко валидированы для оценки потенциала нейтрализации сыворотки или плазмы путем воздействия на вирусный гликопротеин на оболочке ЛП12,13. Нейтрализационная активность, выраженная как ингибирующая концентрация 50 (IC50), определяется как разбавление сыворотки/плазмы, которое блокирует 50% проникновения вирусных частиц14. В этом протоколе мы описали настройку ПВНА для проверки активности антител против тяжелого острого респираторного синдрома – коронавируса 2 (SARS-CoV-2) в сыворотках, собранных до и после получения бустерной дозы вакцины.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на то, что использование вируса дикого типа имитирует реальную инфекцию, лентивирусные ФВ являются более безопасным вариантом для изучения механизмов, связанных с проникновением вируса и инфекцией, без строгих требований безопасности, необходимых для работы с патогенными ви…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем признательность волонтерам из числа медицинских работников. Этот проект был поддержан Департаментом передового опыта 2023/2027, MUR, Италия. AR и DZ были поддержаны PRIN2022 (финансирование ЕС; NextGenerationEU)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
References
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
