Preparazione di semi di palma dura per l'analisi di spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice
Summary
Questo protocollo mirava a descrivere una guida dettagliata sulla preparazione di sezioni di campioni di semi duri a basso contenuto d’acqua per l’analisi MALDI-IMS, mantenendo la distribuzione e l’abbondanza originali degli analiti e fornendo un segnale di alta qualità e una risoluzione spaziale.
Abstract
La spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice (MALDI-IMS) viene applicata per identificare i composti nei loro ambienti nativi. Attualmente, MALDI-IMS è frequentemente utilizzato nelle analisi cliniche. Tuttavia, esiste un’ottima prospettiva per una migliore applicazione di questa tecnica per comprendere le informazioni fisiologiche dei composti chimici nei tessuti vegetali. Tuttavia, la preparazione può essere impegnativa per campioni specifici da materiali botanici, poiché MALDI-IMS richiede fette sottili (12-20 μm) per un’acquisizione dati appropriata e un’analisi di successo. In questo senso, in precedenza, abbiamo sviluppato un protocollo di preparazione del campione per ottenere sezioni sottili di semi duri di Euterpe oleracea (palma açaí), consentendo la loro mappatura molecolare mediante MALDI-IMS.
Qui, mostriamo che il protocollo sviluppato è adatto per la preparazione di altri semi dello stesso genere. In breve, il protocollo si basava sull’immersione dei semi in acqua deionizzata per 24 ore, sull’inclusione di campioni con gelatina e sul sezionamento in un criostato acclimatato. Quindi, per la deposizione della matrice, una piattaforma di movimento xy è stata accoppiata a uno spruzzo ad ago a ionizzazione elettrospray (ESI) utilizzando una soluzione di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) e metanolo 1:1 (v/v) con acido trifluoroacetico allo 0,1% a 30 mg/mL. I dati dei semi di E. precatoria ed E. edulis sono stati elaborati utilizzando un software per mappare i loro modelli di metaboliti.
Gli oligomeri di esoso sono stati mappati all’interno di fette di campione per dimostrare l’adeguatezza del protocollo per quei campioni, poiché è noto che quei semi contengono grandi quantità di mannano, un polimero dell’esoso mannosio. Di conseguenza, sono stati identificati picchi di oligomeri esosi, rappresentati da addotti [M + K]+ di (Δ = 162 Da). Pertanto, il protocollo di preparazione del campione, precedentemente sviluppato su misura per i semi di E. oleracea , ha consentito anche l’analisi MALDI-IMS di altri due semi di palma dura. In breve, il metodo potrebbe costituire un valido strumento per la ricerca nella morfo-anatomia e fisiologia dei materiali botanici, in particolare da campioni resistenti al taglio.
Introduction
La spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice (MALDI-IMS) è un metodo potente che consente l’assegnazione bidimensionale di biomolecole, fornisce un’indagine non mirata di composti ionizzabili e determina la loro distribuzione spaziale, specialmente nei campioni biologici 1,2. Per due decenni, questa tecnica ha permesso il rilevamento e l’identificazione simultanei di lipidi, peptidi, carboidrati, proteine, altri metaboliti e molecole sintetiche come i farmaci terapeutici 3,4. MALDI-IMS facilita l’analisi chimica sulla superficie di un campione di tessuto senza estrazione, purificazione, separazione, etichettatura o colorazione dei campioni biologici. Tuttavia, per un’analisi di successo, un passaggio fondamentale in questa tecnica è la preparazione del campione, in particolare nei tessuti vegetali, che sono specializzati e modificati in organi complessi diffusi a causa dell’acclimatazione ambientale5.
A causa delle proprietà fisico-chimiche intrinseche dei tessuti vegetali, è necessario un protocollo adattato per soddisfare i requisiti dell’analisi MALDI-IMS e preservare la forma originale del tessuto durante la preparazione del sezionamento 6,7. Nel caso di campioni non convenzionali, come i semi, i protocolli stabiliti8 non sono applicabili perché questi tessuti hanno pareti cellulari rigide e un basso contenuto di acqua, che possono facilmente causare la frammentazione della sezione e portare alla delocalizzazione del composto9.
Il nostro gruppo di ricerca ha pubblicato dati sperimentali sulla mappatura molecolare e un protocollo adattato per l’analisi MALDI-IMS del seme di açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, che è un sottoprodotto generato in quantità elevate durante la produzione della polpa di açaí13 affittabile. L’idea era quella di sviluppare un protocollo per la mappatura in situ di diversi metaboliti nei semi di açaí, contribuendo a suggerire possibili usi per questi scarti agricoli che attualmente non sono in fase di esplorazione commerciale. Tuttavia, a causa della resistenza del seme di açaí, è stato necessario creare un protocollo su misura per ottenere un corretto sezionamento del campione dall’analisi MALDI-IMS.
In questo contesto, la polpa di açaí, importante dal punto di vista economico, ha motivato la crescente commercializzazione di altri frutti di palme del genere Euterpe con caratteristiche organolettiche simili. I frutti delle due palme emergenti che sono stati prodotti su scala industriale in alternativa all’açaí14,15 sono E. precatoria (nota come açaí-do-amazonas), che cresce nelle zone aride dell’Amazzonia, ed E. edulis (nota come juçara), tipica della foresta atlantica. Tuttavia, il consumo di açaí-do-amazonas e juçara porta allo stesso accumulo di semi resistenti e non commestibili che non vengono utilizzati e non sono stati studiati finora per quanto riguarda la loro composizione chimica dettagliata.
Pertanto, dimostriamo qui che il protocollo precedentemente ideato può essere utilizzato, con pochi adattamenti, per analizzare i semi di E. precatoria ed E. edulis per la mappatura molecolare da parte di MALDI-IMS, dimostrando di essere un potente strumento che può essere utilizzato per l’analisi della composizione di queste risorse e può aiutare a determinare i loro potenziali usi biotecnologici. Inoltre, la descrizione dettagliata qui fornita può aiutare altri con difficoltà simili nella preparazione di materiali resistenti per l’analisi MALDI-IMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le piante sono composte da tessuti specializzati per specifiche funzioni biochimiche. Pertanto, il protocollo di preparazione del campione per MALDI-IMS deve essere progettato in base a vari tessuti vegetali con specifiche proprietà fisico-chimiche, poiché i campioni devono mantenere la distribuzione e l’abbondanza dell’analita originale per un segnale di alta qualità e una risoluzione spaziale8.
Prima dell’analisi MALDI-IMS, la considerazione principale è la raccol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dall’Istituto Serrapilheira (Serra-1708-15009) e dalla Fondazione Carlos Chagas Filho per il sostegno alla ricerca nello Stato di Rio de Janeiro (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). L’Istituto Serrapilheira e il Consiglio Nazionale per lo Sviluppo Scientifico e Tecnologico (CNPq) hanno concesso borse di studio per il Dr. Felipe Lopes Brum e il Dr. Gabriel R. Martins (Institutional Capacity Building Program/INT/MCTI). Il Coordinamento per il Miglioramento del Personale dell’Istruzione Superiore (CAPES) è riconosciuto per aver concesso una borsa di studio per il Master per il Sig. Davi M. M. C. da Silva. Il Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) è riconosciuto per i servizi forniti con le analisi MALDI-IMS, e il Sig. Alan Menezes do Nascimento e il Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), finanziato dalla sovvenzione MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ Nº 442604/2019, sono ringraziati per l’analisi della composizione elementare.
Materials
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
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