במאמר זה אנו מתארים שיטות לייצור מיקרו-ייצור של ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית (VACNFs), העברת VACNFs למצעים גמישים, ויישום VACNFs על מצעים קשיחים וגמישים לצמחים לצורך העברת ביומולקולות וצבעים.
אספקת ביומולקולות וצבעים בלתי חדירים לצמחים שלמים היא אתגר גדול. ננו-חומרים הם כלים מתקדמים להעברת דנ”א לצמחים. עד כמה שהכלים החדשים האלה מרגשים, הם עדיין לא יושמו באופן נרחב. ננו-חומרים המיוצרים על מצע קשיח (גב) קשים במיוחד ליישום מוצלח על מבני צמחים מעוקלים. מחקר זה מתאר את התהליך לייצור מיקרו-ייצור של מערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית והעברתם ממצע קשיח למצע גמיש. אנו מפרטים ומדגימים כיצד סיבים אלה (על מצעים קשיחים או גמישים) יכולים לשמש לטרנספורמציה חולפת או להעברת צבע (למשל, פלואורסצאין) לצמחים. אנו מראים כיצד ניתן להעביר VACNF ממצע סיליקון קשיח למצע אפוקסי SU-8 גמיש ליצירת מערכי VACNF גמישים. כדי להתגבר על האופי ההידרופובי של SU-8, סיבים בסרט הגמיש היו מצופים בשכבת תחמוצת סיליקון דקה (2-3 ננומטר). כדי להשתמש בסיבים אלה להעברה לאיברי צמח מעוקלים, אנו מפקידים טיפת 1 μL של צבע או תמיסת DNA בצד הסיבים של יריעות VACNF, ממתינים 10 דקות, מניחים את היריעות על איבר הצמח ומשתמשים במטוש בתנועה מתגלגלת כדי להניע סיבים לתוך תאי הצמח. בשיטה זו השגנו העברת צבע ודנ”א באיברי צמחים בעלי משטחים מעוקלים.
טרנספורמציה של צמחים (הן חולפת והן יציבה) עדיין לא הפכה להשגה נרחבת בכל רקמות הצמחים והמינים. הטרנספורמציה הארעית של צמחים היא תהליך שבו גנים המקודדים בפלסמידים מוחדרים באופן זמני לצמחים, אך אינם משולבים באופן יציב בגנום. שיטות מסורתיות המשתמשות בהפצצת חלקיקים, אגרובקטריה, אלקטרופורציה או פוליאתילן גליקול הטיפול בפרוטופלסטים הוא איטי או יכול להיות מסורבל. יתר על כן, הם אינם חלים על כל מיני צמחים 1,2,3,4. השימוש בננו-חומרים להעברת דנ”א הוא תחום מתפתח שנמצא עדיין בחיתוליו5. ננו-חומרים, במיוחד ננו-סיבי פחמן, שימשו בהצלחה גם להעברת חלבונים, דקסטרנים וצבעים לעלי הצמח מבלי לגרום לתגובת פצע6. מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול מפורט לשימוש בסוג אחד של ננו-חומר, ננו-סיבי פחמן, להעברת ביומולקולות או צבעים לצמחים. כאן אנו מתמקדים בדנ”א כביומולקולה המועדפת, המאפשרת טרנספורמציה חולפת של תאים באיברי צמחים שונים.
בעבר, Morgan et al.7 הדגימו את השימוש בננו-סיבי פחמן המודבקים על מצע סיליקון קשיח כדי לשנות באופן זמני עלים של חסה, N. benthamiana , צפצפה, וגם עלים ושורשים של Arabidopsis. למרות שהטרנספורמציות היו מוצלחות על מגוון איברים, סיבים היו קשים יותר ליישום על רקמות צמחים עם משטחים מעוקלים, כגון שורשים או פירות. הנחנו כי גב גמיש לננו-סיבים עשוי לשפר את יעילות ההעברה שלהם על ידי התאמה טובה יותר לצורת האיבר.
במאמר זה, אנו מפרטים שיטות המשמשות לייצור ועיצוב ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית, העברת VACNFs למצעים גמישים, ויישום VACNFs על מצעים קשיחים וגמישים לצמחים כדי לספק ביומולקולות וצבעים. ננו-סיבי פחמן יוצרו באמצעות שקיעת אדים כימית משופרת פלזמה בזרם ישר (dc C-PECVD) עם זרז Ni. המיקום, הקוטר והגובה של נקודות זרז Ni נשלטו באמצעות שילוב של ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים, אידוי מתכת ותהליכי הרמה כפי שתוארו על ידי Melechko et al.8,9. באמצעות התנגדות קרן אלקטרונית דו-שכבתית, ניתן להניח זרז Ni עבה יותר על המצע כדי לתת סיבים ארוכים יותר10. העברת סיבים ממצע קשיח לגמיש מבוססת על שינוי של שיטות המתוארות בפלטשר ואחרים 11, כאשר השיטות הנוכחיות מוותרות על שימוש בשכבת פחמן אמורפית או שכבת פוטו-התנגדות להקרבה. הרמת SU-8 עם העברת סיבים מושגת על ידי ניצול לחץ המתיחה הפנימי הנובע מתת-אפייה ותת-חשיפה של SU-812,13,14. SU-8, פולימר מורכב, הוא הידרופובי באופן טבעי, מה שהופך את השימוש בו להקל על העברת DNA קשה. כדי לנטרל את האופי ההידרופובי של SU-8, אנו מיישמים שכבה דקה של תחמוצת סיליקון באמצעות שקיעת שכבה אטומית15 לאחר שסיבים מוטמעים ב- SU-8. יישום סיבים על מצע קשיח להעברת ביומולקולה/צבע מנצל את כוח ההשפעה של הקשה בפינצטה המתוארת ב- Davern et al.6 ובשיטות על הצמח ועל השבב המתוארות ב- Morgan et al.7. יריעות VACNF גמישות מיושמות על משטחי צמחים מעוקלים על ידי ייבוש למחצה של טיפות DNA או צבע על היריעה, כמו בשיטת On-Chip של Morgan et al.7ולאחר מכן גלגול היריעות על משטחי צמחים מעוקלים באמצעות אפליקטור איפור קטן16,17. איור 1 מתאר גישות שונות ליישום סיבים במצעים קשיחים וגמישים על צמחים.
במאמר זה הצגנו שיטות לבניית מערכי ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית, העברת הסיבים למצע גמיש ויישום סיבים במצע קשיח או גמיש על צמחים לשימוש בהעברת ביומולקולות או צבעים לצמחים. תיארנו שתי גישות כלליות, שיטת ה-on-chip והשיטות on-plant, לשיקוע החומרים שהוכנסו והראינו תוצאות מוצלחות בסיבים על מצע קשיח וכן בשיטת on-chip באמצעות יריעות VACNF. היישום של סיבים אלה פשוט יותר בפרקטיקה ובתיאוריה מאשר שיטות טרנספורמציה מסורתיות של צמחים (הפצצת חלקיקים, טרנספורמציה של פרוטופלסט באמצעות PEG או אלקטרופורציה) וניתן להשתמש בהם עבור צמחים סרבנים להתמרה בתיווך אגרובקטריום. עם זאת, רק תאים מעטים עוברים טרנספורמציה.
ננו-סיבי פחמן מיושרים אנכית יוצרו במרכז המעבדה הלאומית אוק רידג’ למדעי החומרים הננופאזיים באמצעות תוכנית המשתמש שלהם. משתמשים יכולים להגיש בקשה להשתמש במתקן זה לייצור VACNFs. לחלופין, ניתן לייצר שבבי VACNF בחדרים נקיים עם מכונות שקיעת אדים כימיים משופרות פלזמה בזרם ישר עם מקור פחמן22,23. עם השיטות המתוארות, ישנם מספר שלבים קריטיים לייצור הסיבים, העברת סיבים ויישום שבבים/יריעות VACNF. כדי שיישום סיבים יעבוד, סיבים חייבים להיות ישרים ולהיות בעלי קוטר מתחדד של <200 ננומטר בקצה כדי שהאספקה בתאי הצמח תהיה מוצלחת 6,7 (איור 3). כדי ליצור ננו-סיבי פחמן בגודל וגובה מסוימים, ישנם מגוון פרמטרים שניתן לשנות, כולל גודל הנקודה, המגרש הרוחבי וכמות הזרז שהושקע. כדי לבחור את גודל הנקודה האופטימלי שישמש לייצור ננו-סיבי פחמן, גידלו סיבים מגדלי נקודות שונים (כפי שמוצג באיור 5). מצאנו שקוטר של 300 ננומטר מייצר את הסיבים הטובים ביותר, ולכן גודל הנקודה הזה נבחר (איור 5). לאחר שמצאנו את הפרמטרים הנכונים, חיפשנו להשתמש בשבבים שיש להם >50% מהסיבים עם הגיאומטריה האידיאלית (ישר וקוטר קצה <200 ננומטר). כדי לבדוק את הגיאומטריה של הסיבים, השתמשנו במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצלם שדות ראייה אקראיים על דגימה של שבבים/יריעות VACNF.
בנוסף, הסיבים חייבים להיות באורך מינימלי מסוים כדי להשיג אספקה בתוך תאי הצמח. החשיבות של ייצור סיבים באורכים שונים היא שניתן להשתמש בסיבים ארוכים יותר כדי לחדור לשכבות רקמות עמוקות יותר. סיבים ארוכים יותר (>40 מיקרומטר אורך) חיוניים עבור יריעות גמישות כמו העברת סיבים עובד על ידי שבירת הסיבים מבסיסם דורש שכבות SU-8 על גבי הסיבים. עובי העבודה של שכבת SU-8 המשמשת לפרוטוקול זה הוא 20-35 מיקרומטר. הגובה המינימלי הדרוש כדי להשיג משלוח בתוך האפידרמיס של צמחים שונים (מעוקל או שטוח) הוא 10-15 מיקרומטר 6,7. כתוצאה מכך, סיבים באורכים >40 מיקרומטר נחוצים עבור יריעות VACNF. ישנם מספר פרמטרים שונים שיש לקחת בחשבון בעת ייצור ננו-סיבי פחמן: חומר זרז, גיאומטריית זרז, עובי חומר זרז וכן תנאים בתוך תא PECVD (יחס גז, לחץ, טמפרטורה, זרם, גובה ראש מקלחת וזמן גידול)8,9,24,25. כדי לייצר ננו-סיבי פחמן ארוכים מ-25 מיקרומטר המשמשים את Morgan et al.7 ו-Davern et al.6, הגדלנו את כמות הזרז Ni, שינינו את יחס האצטילן: אמוניה, והגדלנו את הזרם ואת זמן הגידול. בנוסף, הקדשנו תשומת לב רבה יותר לגיאומטריה של חומר הזרז. כדי לייצר סיבים ישרים גבוהים, הזרז שהושקע היה צריך להיות בעל צורת פאק הוקי ולא צורה שמזכירה הר געש (איור 4). מבני הר געש נובעים משאריות של photoresist לאחר המראה. כדי למנוע היווצרות הרי געש, נעשה שימוש בשכבה כפולה של PMMA ליצירת חתך תחתון במהלך ליתוגרפיית קרן אלקטרונים26. החתך התת-קרקעי מסייע בהתרוממות של זרז המתכת שהושקע (איור 2). השכבה העבה של הזרז חשובה לצמיחה של VACNF גבוהים. המורפולוגיה של VACNFs נבדקה על ידי Merkulova et al.24. היישור האנכי של VACNFs נובע הן מהצמיחה מסוג קצה זרז Ni והן מהיישור של פוטנציאל DC בניצב למצע (איור 6). ראש המקלחת מתאר את הגיאומטריה של כור PECVD (איור 6) ומשמש כמקור לפוטנציאל לשדה החשמלי27.
כדי להגדיר את מערך נקודות הזרז עם ליתוגרפיית קרן אלקטרונים, יישמנו התנגדות לקרן אלקטרונים (פולימתיל מתקרילט), ולאחר מכן השתמשנו באלומת האלקטרונית כדי ליצור חורים קטנים בהתנגדות עם צורה מסוימת ובמיקומים ספציפיים על רקיק. חורים בקוטר הרצוי הונחו על רשת רגילה עם המרווח המוגדר (גובה) וקובץ המציין את התבנית הרצויה נטען בכלי הליתוגרפיה של קרן אלקטרונים לפני טעינת המצע למכונה. בנוסף לגובה הסיבים, פרמטר קריטי נוסף להעברת סיבים מוצלחת הוא משך הזמן המושקע באמבט אצטון. סרטי VACNF צריכים להישאר באמבט אצטון מספיק זמן כדי שהקצוות שלהם יתחילו להתעקל; אם הם נשארים באמבט אצטון מעט מדי זמן, קשה יותר להרים אותם מהשבבים והם עלולים להישבר. ככל שהצ’יפס ישן יותר, כך הם יצטרכו להישאר זמן רב יותר באמבט אצטון. לאחר אמבט האצטון, הסרטים / שבבים הוכנסו לאיזופרופנול ומים כדי להסיר אצטון גישה וכן כדי להסיר את הפוטו-התנגדות המגנה על הסיבים.
כדי לבצע ציפוי ספין, ופלים או חתיכות רקיק ממוקמים על צ’אק ואקום בקואטר הסחיטה, והמיקום המרכזי של הפרוסות מאומת באמצעות פונקציית הבדיקה של קואטר הסחרור. שלולית קטנה (~ 2.5 ס”מ קוטר) של התנגדות מוחלת על מרכז רקיק ומסובבת (3000 סל”ד במשך 45 שניות) תמונות של הסיבים לפני ואחרי ציפוי הסחרור כלולות באיור 8 המראות את שימור גיאומטריית הסיבים (גובה, כיוון וגובה). נוכחות הסיבים גורמת להתנגדות להצטברות בבסיס הסיבים והתוצאה היא שכבות עבות מהצפוי. ציפוי ספין לאחר צמיחת VACNF נבדק על ידי קבוצות אחרות11,18.
צעד נוסף בתהליך שהוא בעל חשיבות מכרעת הוא לוודא שכמות הכוח הנכונה מופעלת על שבבים/יריעות VACNF. מנגנון ההולכה תלוי בסיבים היוצרים נקבים קטנים בדפנות התא באמצעות כוח הדחף של הפינצטה המקישים על מצעים קשיחים 6,7 או מתגלגלים עם המוליך המיני איפור על מצעים גמישים. סיבים עשויים להישבר או לא להישבר ולהישאר טבועים בתאי הצמח6,7 ללא השפעה על התוצאה, אך תרגול בשילוב עם בדיקת ספיגת צבע ונזק לרקמות הוא הכרחי כדי לקבל את הלחץ הנכון. נוסף על כך, חשוב לבחור נקודות זמן מתאימות להדמיה לאחר מסירת דנ”א עם שבבים/יריעות VACNF מאחר שהזמן לביטוי ניתן לזיהוי משתנה בין מיני צמחים לבין סוגי הווקטורים המועברים7 (איור 16).
עד כמה ששיטה זו ישימה באופן רחב על צמחים, יש לה כמה מגבלות. לדוגמה, הוספת שכבה דקה של תחמוצת סיליקון ליריעות VACNF לא תמיד גורמת לכך שהיריעות יהיו הידרופיליות לחלוטין בגלל שכבת ההגנה של התנגדות האור שנוספה על גבי SU-8. אם בעיה זו תתממש, שכבות עבות יותר של תחמוצת סיליקון יכולות להיות מיושמות על VACNFs. כדי לבדוק אם הסרטים הם הידרופוביים או הידרופיליים, הם יכולים להיות ממוקמים במים. אם היריעות שוקעות, הן הידרופיליות, ואם הן צפות, הן הידרופוביות. בנוסף, יכולה להיות שונות בין אצוות של סיבים המיוצרים. ישנם מספר פרמטרים שניתן לשנות בעת גידול הסיבים במכונת dc -PECVD; מה שמתואר בפרוטוקול זה הוא קבוצה של פרמטרים עבור שתי כמויות שונות של זרז Ni. בנוסף, לא ניתן לשלוט בכיוון הגבישי של זרז Ni28 והסתעפות מסוימת תגרום בהכרח לסיבים.
בעוד שהדגמנו העברה של צבע פלואורסצאין ודנ”א לתאי צמחים באמצעות מצעים קשיחים וגמישים עבור מאמר זה, השיטה צריכה להיות ישימה באופן נרחב עבור ביומולקולות אחרות וגישות שינוי גנטי, לדוגמה, השתקת RNAi עבור מערכות צמחים כמו תפוחים או פירות אחרים, שם ייקח שנים לייצר קווים טרנסגניים יציבים. יתר על כן, סיבים אלה יכולים לשמש גם להעברת חומרי עריכה גנטיים או לטרנספורמציות יציבות בצמחים.
The authors have nothing to disclose.
מערכי ננו-סיבים יוצרו במרכז למדעי החומרים הננופאזיים, שהוא מתקן משתמש של משרד האנרגיה של המדע (מזהה הצעה: CNMS2019-103 ו-CNMS2022-A-1182). תמיכה מ- CNMS מוענקת באמצעות מערכת הצעות שנבדקה על ידי עמיתים וניתנת ללא עלות למועמדים מוצלחים המתכוונים לפרסם את תוצאותיהם (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). אנו מודים לקווין לסטר ול-CNMS על הסיוע בייצור מערכי ננו-סיבים. אנו מודים לד”ר ג’ון קוגמן, ד”ר טימותי מקנייט, ד”ר אמבר ווב, דריל בריגס וטראוויס בי על דיונים ביקורתיים על תכנון ניסויים. אנו מודים לד”ר אדם רונדינונה על הסכימה של מכונת PECVD. אנו מודים ללזלי קרול על האיורים המדעיים. עבודה זו מומנה על ידי התוכנית למדעי הדימות הביולוגי, משרד האנרגיה של ארה”ב, משרד המדע, המחקר הביולוגי והסביבתי, DE-SC0019104 ומשרד החקלאות של ארצות הברית, 2021-67013-34835. JMM נתמך על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית: המכון הלאומי למזון וחקלאות: מלגת פרה-דוקטורט של יוזמת החקלאות וחקר המזון 2021-67034-35167.
13" x 13" White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct | Fastenal | 690535 | |
2-Propanol (IPA) | Fischer Scientific | A451-4 | |
4" Lid | Entegris | H22-401-0615 | Wafer Carriers |
4" tray | Entegris | H22-40-0615 | Wafer Carriers |
Accretech SS10 dicing saw | Accreteck | SS10 | |
Acetone | Fischer Scientific | A18-4 | |
Acetone used in the cleanroom at ORNL | JT Baker | 9005-05 | |
Apples | Grocery store | No product number | |
Arabidopsis thaliana | Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago | No product number | |
Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine | Oak Ridge National Laboratory | Custom-built | |
Cobham Green lettuce | Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis | No product number | Butterhead lettuce |
Fluorescein dye | Sigma Aldrich | F2456-2.5G | |
Gel-box | Gel-Pak | AD-23C-00-X4 | |
Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool | Heidelberg | DWL 66 | |
ImageJ | National Institues of Health | No product number | |
Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL | Doe and Ingalls | CMOS Grade 9079-05 | |
JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system | JEOL | 8100 | |
Kimwipes | Kimtech | Kimberly-Clark Professional 34120 | |
Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish | VWR | 11019-554 | |
Layout Editor | juspertor GmbH | No product number | |
LSM 710 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
LSM 800 confocal microscope | Zeiss | No product number | |
Make-up applicator | Amazon | G2PLUS | 500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS |
Merlin field emission scanning electron microscope | Zeiss | Merlin | |
MIBK/IPA (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3) | Microchem | M089025 | |
Onions | Grocery store | No product number | |
Oxford FlexAl atomic layer deposition | Oxford | FlexAl | |
PMMA 495 A4 | Microchem | M130004 | |
PMMA 950 A4 | Microchem | M230004 | Can dilute down to A2 |
Polyethylene terephthalate (PET) | Amazon | KS-6304-21-11 | Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005" Thick x 27" Width x 10 Ft Length 1 pc |
Precision tweezers | Aven Inc. | 18032TT | |
pUBQ10:YFP-GW | Arabidopsis Biological Resource Center | CD3-1948 | |
Silicon etcher (used for descum) | Oxford | Plasmalab | |
Silicon rubber kit | Smooth-On Inc | Ecoflex 00-20 | |
Silicon wafers | Pure Wafer | 4N0.001-.005SSP-INV | |
Spin coater | Brewer Sciences | Model 100CB | |
SPR 955cm 0.7 | Megaposit | 10018314 | |
Strawberries | Grocery store | No product number | |
SU-8 2015 | Microchem | SU-8 2000 Series | Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
SU-8 developer | Microchem | SU-8 2000 Series | Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing. |
Suss MicroTec contact aligner | Suss MicroTec | MA6/BA6 | |
Table top microscope | Phenom XL | used for checking Ni catalysts after metal deposition | |
Thermionics VE-240 e-beam evaporator | Thermionics | VE-240 |