Verwendung von Vogelhautexplantaten zur Untersuchung der Gewebemusterung und Organogenese
Summary
Hier beschreiben wir Protokolle für drei Arten von embryonalen Hautexplantatkulturen von Vögeln, die zur Untersuchung von Gewebeinteraktionen, 4D-Bildgebungs-Zeitrafferfilmen (3D plus Zeit), globalen oder lokalen Störungen der molekularen Funktion und systembiologischer Charakterisierung verwendet werden können.
Abstract
Die sich entwickelnde Vogelhaut während der Embryogenese ist ein einzigartiges Modell, das wertvolle Einblicke in die Gewebemusterung liefern kann. Im Folgenden werden drei Varianten von Hautexplantatkulturen beschrieben, um verschiedene Aspekte der Hautentwicklung zu untersuchen. Erstens bieten Ex-vivo-Organkulturen und -Manipulationen den Forschern die Möglichkeit, die Entwicklung von Federknospen direkt zu beobachten und zu untersuchen. Die Explantatkultur der Haut kann 7 Tage lang wachsen, was eine direkte Analyse des zellulären Verhaltens und 4D-Bildgebung in Intervallen während dieser Wachstumsperiode ermöglicht. Dies ermöglicht auch physikalische und molekulare Manipulationen der Kulturbedingungen, um die Gewebereaktion sichtbar zu machen. Zum Beispiel können mit Wachstumsfaktoren beschichtete Kügelchen lokal aufgetragen werden, um Veränderungen in der Federmusterung in einem begrenzten Bereich zu induzieren. Alternativ kann die virale Transduktion global in den Nährmedien verabreicht werden, um die Genexpression zu erhöhen oder herunterzuregulieren. Zweitens ermöglicht das Hautrekombinationsprotokoll den Forschern, Gewebeinteraktionen zwischen Epidermis und Mesenchym zu untersuchen, die aus verschiedenen Hautregionen, verschiedenen Lebensstadien oder verschiedenen Arten stammen. Dies bietet die Möglichkeit, das Zeitfenster zu testen, in dem das Epithel in der Lage ist, auf Signale zu reagieren, und seine Fähigkeit, verschiedene Hautanhänge als Reaktion auf Signale aus verschiedenen mesenchymalen Quellen zu bilden. Drittens setzt die Hautrekonstitution mit dissoziierten Hautzellen, die mit intaktem Epithel überlagert sind, die Hautentwicklung zurück und ermöglicht die Untersuchung der anfänglichen Prozesse der periodischen Musterbildung. Dieser Ansatz verbessert auch unsere Fähigkeit, die Genexpression zwischen den dissoziierten Zellen zu manipulieren, bevor das rekonstituierte Hautexplantat erstellt wird. In diesem Artikel werden die drei Kulturprotokolle und beispielhafte Experimente vorgestellt, um ihren Nutzen zu demonstrieren.
Introduction
Die Entwicklung der Haut von Vogelembryonen ist aufgrund der unterschiedlichen Muster und des Zugangs zu Mikrochirurgie und -manipulation ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Morphogenese 1,2. Die Bewertung zellulärer und molekularer Ereignisse in intaktem Gewebe kann jedoch schwierig sein, da das Vorhandensein von Fremdgewebe mikroskopische Beobachtungen erschweren kann. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren, um ihre Rolle bei der Morphogenese der Haut zu testen, nicht immer eine einfache Aufgabe. Wir stellen fest, dass wir Genfunktionen mittels retroviraler Transduktion mit einer höheren Erfolgsrate unter Verwendung von Hautexplantatmodellen testen können. Hier gehen wir auf die Vorteile von drei Hautexplantatmodellen ein, die entwickelt wurden.
Die embryonale Hautkultur von Vögeln ist ein leistungsfähiges System zur Beurteilung des Zellverhaltens, der Genregulation und der Funktion während der Entwicklung von Hautfederknospen 3,4,5,6. Es ermöglicht die Bewertung der molekularen Mechanismen der Entwicklung von Federknospen durch die globale Zugabe von Wachstumsfaktoren, die in das Kulturmedium eingebracht werden, oder deren lokale Freisetzung aus Wachstumsfaktor-beschichteten Kügelchen. Entwicklungsregulatorische Gene können auch durch virale Gentransduktion intakter oder dominanter negativer Formen für funktionelle Studien manipuliert werden, um ihre Rolle bei spezifischen morphogenetischen Ereignissen zu bewerten 7,8.
Die epithelial-mesenchymale Rekombinationskultur von Vögeln ermöglicht es den Forschern, die Beiträge der einzelnen Hautkomponenten in den frühen Stadien der Hautmorphogenese zu bestimmen. Rawles’ Anwendung dieses Ansatzes zeigte, dass Wechselwirkungen zwischen dem Mesenchym und dem Epithel für die Bildung von Hautanhängen unerlässlich sind9. Das Mesenchym kann Kondensationen bilden, und das Epithel wird benötigt, um mesenchymale Kondensationsbildungen zu induzieren und aufrechtzuerhalten2. Später wurde dieser Ansatz verwendet, um zu beurteilen, warum schuppenlose Hühner keine Federn bilden. Es wurde festgestellt, dass der Defekt im Mesenchym10 liegt. Dhouailly führte Studien zur epithelial-mesenchymalen Rekombination von Gewebe an Embryonen verschiedener Spezies durch. Diese Studien lieferten entwicklungs- und evolutionäre Einblicke in die epithelial-mesenchymale Kommunikation, die die Morphogenese der Haut fördert3.
Diese Studie wurde verwendet, um Faktoren, die das Federwachstum steuern, besser zu verstehen. Die Methode verbessert auch die Visualisierung zellulärer und molekularer Ereignisse, die an der Hautmusterung beteiligt sind und während der Initiierung, Entwicklung und Verlängerung der Federn entlang der anterior-posterioren Achse stattfinden. Wenn das Epithel vom Mesenchym getrennt wird und die beiden Komponenten dann wieder kombiniert werden, stellen neue Wechselwirkungen die Hautmusterung wieder her. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, mesenchymale induzierende Signale und epitheliale Kompetenzmoleküle zu bewerten, die es der Epidermis ermöglichen, auf die mesenchymalen Signale zu reagieren11. Die anschließende nachgeschaltete molekulare Expression, die für die Entwicklung der Federknospen und die Musterbildung erforderlich ist, kann ebenfalls untersucht werden. Diese Studien haben gezeigt, dass die Position der Knospen durch das Mesenchym gesteuert wird. Die Rotation des Epithels um 90o vor der Rekombination mit dem Mesenchym zeigt, dass die Richtung der Federknospenverlängerung durch das Epithel gesteuert wird. Diese Methode war für uns unerlässlich, um den molekularen Mechanismus zu untersuchen, der die Ausrichtung der Federknospen reguliert12.
Die Rekonstitutionskultur der Vogelhaut, in der das Hautmesenchym in einzelne Zellen dissoziiert wird, bevor es mit hoher Zelldichte plattiert und mit intaktem Epithel überlagert wird, versetzt die Hautzellen in einen primordialen Zustand. Das Explantat organisiert sich dann selbst, um ein neues periodisches Muster zu bilden, das unabhängig von den vorherigen Hinweisen13 ist. Dieses Hautrekonstitutionsmodell kann verwendet werden, um die ersten Prozesse der periodischen Musterbildung von Federn zu untersuchen. Wir haben diesen Ansatz verwendet, um zu untersuchen, wie die Modulation des Verhältnisses von mesenchymalen Zellen zu einem einzelnen Stück Epithel die Größe oder Anzahl der Federknospen beeinflussen kann. Es wurde festgestellt, dass die Anzahl der Knospen zunahm, aber nicht die Größe der Knospen, da das Verhältnis der mesenchymalen Zellen zunahm. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die mesenchymale zelluläre Virustransduktion eine höhere Effizienz aufweist als unter den beiden anderen Kulturbedingungen und offensichtlichere Phänotypen hervorbringen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Geweberekombination bietet einen Assay, um die einzigartigen Beiträge des Epithels und des Mesenchyms zu untersuchen. Bei Hühnern beginnen sich die Federn am Embryonaltag 7 (E7) zu entwickeln, während die Schuppen am E9 beginnen. Wenn das Mesenchym der E9-Schuppe mit dem Federepithel E7 rekombiniert wird, bildet das rekombinierte Gewebe Schuppen, und wenn das Mesenchym der E7-Feder mit dem Epithelfeder der E9-Schuppen rekombiniert wird, werden Federn gebildet11. Diese Studien haben gezeigt,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch die NIH-NIAMS-Zuschüsse R37 AR 060306, R01 AR 047364 und RO1 AR078050 unterstützt. Die Arbeit wird auch durch einen gemeinsamen Forschungsvertrag zwischen der USC und der China Medical University in Taiwan unterstützt. Wir danken der Klasse USC BISC 480 Developmental Biology 2023 für die erfolgreiche Erprobung dieses Vogelhautkulturprotokolls in mehreren Labormodulen.
Materials
| 6-well culture dish | Falcon | REF 353502 | Air-Liquid Interface (ALI) Cultures |
| Cell culture inset | Falcon | REF 353090. | 0.4 µm Transparent PET Membrane |
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Corning | 10-013-CV | 4.5 g/L glucose |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 16140-071 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hanks’s buffered saline solution | Gibco | 14170-112 | No calcium, no magnesium |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15-140-122 | |
| Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (Nacl) | EMD | CAS 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Trypsin | Gibco | 27250-042 |
References
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