In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

HINWEIS: Alle Zellkulturtechniken müssen unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, und die Zellen müssen bei 37 °C in einer humifizierten Atmosphäre mit 5 % CO2 inkubiert werden. Anweisungen für alle Zytokinpräparate sowohl für die Erhaltungstherapie (rhbFGF) als auch für das Differenzierungsprotokoll (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) finden Sie in der Zusatztabelle S1. 1. Kultivierung von hiPSCs – Auftauen, Pflegen und Einfrieren von Zellen Herstellung von Erhaltungsmedium, Wachstumsfaktoren und anderen ReagenzienBereiten Sie das Nährmedium vor, indem Sie das gesamte serumfreie Medium hESCs, 36 ml 25 % Rinderserumalbumin (BSA) und 1 ml 55 mM β-Mercaptoethanol zu Dulbeccos Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) Basalmedium hinzufügen (siehe Materialtabelle). Resuspendieren Sie 1 mg Rho-Kinase-Inhibitor (iRock) in 1 ml DMSO, stellen Sie Aliquoten von 50 μl her und lagern Sie sie bei -20 °C.HINWEIS: Diese Aliquots können 1 Jahr lang bei -20 °C aufbewahrt werden. Nach dem Auftauen sind sie 1 Woche bei 4 °C haltbar. Die Vitronektin-Lösung (VTN-N) wird vor der Lagerung bei -80 °C auf Eis und aliquoten 60 μl pro Durchstechflasche aufgetaut. Kurz vor dem Beschichten der Platten verdünnen Sie den 60-μl-Stamm in 6 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco. die Endkonzentration von 5 μg/ml. Auftauen von hiPSC-ZelllinienANMERKUNG: Die humane pluripotente Stammzelllinie SFCi55 wurde zuvor intern entwickelt und in großem Umfang für die Differenzierung in verschiedene Zelltypen und verschiedene embryonale Linien verwendet 19,20,21,22.Eine Vertiefung einer 6-Well-Platte mit 1 ml VTN-N-Lösung für 1 h bei 37 °C beschichten.HINWEIS: Nach der Inkubation können beschichtete Platten bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden. Die VTN-N-Lösung wird mit einer Aspirationspipette abgesaugt und 1 ml vorgewärmtes Nährmedium mit 20 ng/ml rhbFGF hinzugefügt (Ergänzungstabelle S1). Tauen Sie das Fläschchen mit den hiPS-Zellen schnell in einem Wasserbad auf und überführen Sie die Zelle in 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium. Schleudern Sie die Zellen für 3 Minuten bei 300 × g bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml Kulturmedium, ergänzt mit 20 ng/ml rhbFGF. Überführen Sie die Zellen in eine beschichtete Vertiefung, die bereits 1 ml Medium enthält. Geben Sie 5 μl iRock in die Vertiefungen mit den Zellen in insgesamt 1,5 ml Medium. Kultivieren Sie die Zellen im Inkubator, wechseln Sie das Medium täglich während der Woche und füttern Sie die Zellen doppelt, indem Sie den Zellen das Doppelte des normalen Mediumvolumens hinzufügen, um die Fütterung über das Wochenende zu gewährleisten.HINWEIS: Die Zellen werden nur 24 Stunden lang in Gegenwart von iRock gezüchtet. Wartung und Weiterleitung von hiPSCsWechseln Sie das Medium täglich mit frischem, vorgewärmtem Nährmedium, das mit 20 ng/ml rhbFGF ergänzt wird. Passieren Sie die Zellen, wenn sie eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht haben, in der Regel zweimal pro Woche.Um die Zellen zu passieren, wird eine Platte mit VTN-N beschichtet, wie zuvor in den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 beschrieben. Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen mit Zellen an und waschen Sie sie mit DPBS. Das DPBS absaugen und 1 ml Dissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) zugeben und 1 Minute lang inkubieren. Das Dissoziationsreagenz wird abgesaugt und weitere 3 Minuten inkubiert. Klopfen Sie auf jeder Seite 10 Mal fest auf die Platte.HINWEIS: Der Dissoziationsschritt muss möglicherweise zelltypspezifisch in Bezug auf die Inkubationszeit und das Klopfverfahren optimiert werden. Geben Sie 1 ml Kulturmedium zu den Zellen und waschen Sie es mit einer Pasteur-Pipette einmal mit dem Medium, um sicherzustellen, dass die meisten Kolonien gesammelt werden. Geben Sie 150 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung, um ein Durchgangsverhältnis von 1 Vertiefung in 6 zu erhalten.HINWEIS: Unmittelbar nach dem Auftauen einer neuen Durchstechflasche ist es besser, die Zellen in einem niedrigeren Verhältnis wie 1:1 oder 1:2 für ein oder zwei Durchgänge zu passieren, damit sie eine stetige Wachstumsphase erreichen können, bevor sie in einem Verhältnis von 1:6 passieren. Kultivieren Sie die Zellen im Inkubator, wechseln Sie das Medium täglich während der Woche und füttern Sie die Zellen einmal am Wochenende. Einfrieren von hiPS-ZelllinienHINWEIS: Frieren Sie die Zellen in den ersten beiden Durchgängen nach dem Auftauen ein, um sicherzustellen, dass eine konstante Charge gefrorener Fläschchen mit niedriger Passage erhalten bleibt, um die Kultur zu starten. Frieren Sie die Zellen ein, wenn sie eine Konfluenz von ca. 80 % erreichen.Wechseln Sie das Medium zu frischem, vorgewärmtem Nährmedium, das mit 20 ng/ml rhbFGF und 5 μl iRock ergänzt wird, und inkubieren Sie mindestens 1 h. Trennen Sie die Zellen wie in den Schritten 1.3.2.2 bis 1.3.2.5 beschrieben. Die abgelösten Zellen werden in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 ml Kulturmedium gesammelt. 3 min bei 300 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 1 ml Kryokonservierungslösung hinzu (siehe Materialtabelle). Pipettieren Sie die Zellen mit einer Pasteurpipette vorsichtig auf und ab, um sie in der Kryokonservierungslösung zu mischen.HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßiges Pipettieren, da dies zu einer Dissoziation der Zellcluster führen kann. Teilen Sie die Zellsuspension in zwei Kryokonservierungsfläschchen mit je 0,5 ml auf. Die Kryokonservierungsfläschchen werden in einen Kryokonservierungsbehälter überführt, der auf 4 °C vorgekühlt ist. Den Behälter mit den Zellen für 24 Stunden in einen Gefrierschrank bei -80 °C stellen, bevor die Fläschchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt werden. 2. Differenzierung von hiPS-Zellen zu Endothelzellen Herstellung von Differenzierungsmedium, Zytokinen und WachstumsfaktorenSerumfreies Differenzierungsmedium (SFD) gemäß Tabelle 1 herstellen. Verwenden Sie dieses Medium von Tag 0 bis Tag 5 der Differenzierung. Bereiten Sie serumfreies Medium für CD34+ -Zellen (SFM-34) vor, indem Sie 34 Nährstoffpräparate und 5 ml L-Glutamin-Präparat zu dem 34 SFM Basalmedium hinzufügen (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie dieses Medium ab dem 6. Tag der Differenzierung. Resuspendieren Sie 1 mg CHIR99021 in 716 μl DMSO, um eine 3 mM Lösung zu erhalten. Bei Raumtemperatur inkubieren, bis es vollständig resuspendiert ist; bei Bedarf schnell auf 37 °C aufwärmen. Stellen Sie 20 μl Aliquots her und lagern Sie diese bis zu 6 Monate bei -20 °C. Sofort nach dem Auftauen verwenden und nicht wieder einfrieren oder lagern. Resuspendieren Sie die Zytokine gemäß den Anweisungen in der Ergänzenden Tabelle S1. Lagern Sie alle Zytokine bei -80 °C. Differenzierung von EndothelzellenANMERKUNG: Für jeden Tag der Differenzierung sind 18 ml (3 ml Medium/Well) vorgewärmtes SFD-Medium gemäß den Zytokinmischungen vorzubereiten, die in Tabelle 2.Tag 0 – Bildung von Embryoidkörpern (EBs)Bereiten Sie 18 ml SFD-Medium mit Mix 1 Zytokin gemäß Tabelle 2 für jede 6-Well-Platte (3 ml/Well) vor. Geben Sie 2 ml vorgewärmtes SFD-Medium mit Mix 1 Zytokin in jede Vertiefung einer zellabweisenden 6-Well-Platte (siehe Materialtabelle). Um EBs zu bilden, führen Sie die in den Schritten 1.3.2.2-1.3.2.4 beschriebenen Schritte aus.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die hiPSCs zu 70-80 % konfluierend sind, um die Differenzierung zu starten. Geben Sie 1 ml vorgewärmtes SFD-Medium mit Mix 1 Zytokinen in jede Vertiefung der abgelösten Zellcluster. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um die Zellcluster vorsichtig in eine einzige Vertiefung mit zellabweisender Vertiefung für die EB-Bildung im Verhältnis 1:1 zu übertragen. Nachdem Sie die Platte in den Inkubator gelegt haben, bewegen Sie sie nach vorne und hinten, nach rechts und links, um die EBs gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen. Tag 1 – Mediumwechsel zu den EBsHINWEIS: Dieser Schritt ist nur notwendig, wenn am Tag 1 der Differenzierung neben den EBs viele Einzelzellen in Suspension vorhanden sind.Bereiten Sie 18 ml SFD-Medium mit Mix 1 Zytokin gemäß Tabelle 2 für jede 6-Well-Platte (3 ml/Well) vor. Schwenken Sie die Platte mit den EBs, um sie in die Mitte zu bewegen, und sammeln Sie sie mit einer Pasteur-Pipette in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.HINWEIS: Wenn die EBs wie in Fäden verklumpt aussehen, trennen Sie sie, indem Sie sie mit einem P1000 auf und ab pipettieren, bevor Sie sie in das 15-ml-Zentrifugenröhrchen sammeln. Warten Sie 5-10 Minuten, bis sich die EBs am Boden des Röhrchens abgesetzt haben.HINWEIS: Wenn die EBs zu klein sind, zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 100 × g , damit sie sich absetzen. Waschen Sie die zellabweisenden Platten mit sterilem Wasser oder DPBS, um einzelne Zellen oder Ablagerungen zu entfernen. Saugen Sie den Überstand vorsichtig und langsam von den EBs ab, ohne sie zu lösen. Geben Sie 2 ml SFD mit gemischten 1 Zytokinen in jede Vertiefung der zellabweisenden Platten. Resuspendieren Sie die EBs mit 1 ml SFD-Medium und mischen Sie 1 Zytokine für jede Ausgangsvertiefung – für eine 6-Well-Platte fügen Sie 6 ml Medium hinzu. Übertragen Sie die EBs in 1 ml Volumen pro Well, die bereits 2 mL SFD-Medium enthält, auf die zellabweisenden Platten. Nachdem Sie die Platte in den Inkubator gelegt haben, bewegen Sie sie nach vorne und hinten, nach rechts und links, um die EBs gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen. Tag 2 – Hinzufügen von CHIR99021Schwenken Sie die EBs in die Mitte der Platte und fügen Sie CHIR99021 gemäß Tabelle 2 an der Seite der Vertiefung hinzu, um einen direkten Kontakt mit den Zellen zu vermeiden.HINWEIS: Wenn das Medium an Tag 1 nicht gewechselt wurde, ersetzen Sie das gesamte Medium, anstatt CHIR allein hinzuzufügen. Bereiten Sie 18 ml SFD-Medium mit Mix 2 gemäß Tabelle 2 für jede 6-Well-Platte (3 ml/Well) vor. Nachdem Sie die Platte in den Inkubator gelegt haben, bewegen Sie sie nach vorne und hinten, nach rechts und links, um die EBs gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen. Tag 3 – Mediumwechsel der EBs und Zugabe von Mix 3 ZytokinenBereiten Sie 18 ml SFD-Medium mit Mix 3 Zytokinen gemäß Tabelle 2 für jede 6-Well-Platte (3 ml/Well) vor. Sammeln Sie die EBs wie in den Schritten 2.2.2.2-2.2.2.4 beschrieben. Geben Sie vorgewärmte 2 ml SFD-Medium mit Mix 3 Zytokinen zu den zellabweisenden Platten. Saugen Sie den Überstand vorsichtig von den EBs ab. Fügen Sie 1 ml/Well SFD mit Mix 3 Zytokinen hinzu. Verteilen Sie die EBs wie in den Schritten 2.2.2.8-2.2.2.9 beschrieben auf die Vertiefungen. Tag 6 – Mediumwechsel für SFM-34 und Zugabe von Mix 4 ZytokinenBereiten Sie 18 ml SFD-Medium mit Mix 4 Zytokinen gemäß Tabelle 2 für jede 6-Well-Platte (3 ml/Well) vor. Sammeln Sie die EBs wie in den Schritten 2.2.2.2-2.2.2.4 beschrieben. Geben Sie 2 ml vorgewärmtes SFM-34-Medium mit Mix 4 Zytokinen zu den zellabweisenden Platten. Saugen Sie den Überstand vorsichtig von den EBs ab. Fügen Sie 1 ml/Well SFM-34 mit Mix 4 Zytokinen hinzu. Verteilen Sie die EBs wie in den Schritten 2.2.2.8-2.2.2.9 beschrieben auf die Vertiefungen. 3. Isolierung von CD34+ -Zellen und Seeding in den Chip HINWEIS: CD34+ -Zellen werden über einen positiven Isolationsansatz mit einem CD34-Mikrokügelchen-Kit (siehe Materialtabelle) isoliert, das CD34-Mikrokügelchen enthält, die mit monoklonalen Mausantikörpern, antihumanen CD34-Antikörpern und FcR-Blockierungsreagenz (humanes IgG) konjugiert sind. Es ist wichtig, die Effizienz der Säulenisolierung zu validieren, indem die Zellen vor und nach der Isolierung für die Durchflusszytometrie gefärbt werden. Unten wird angegeben, wann Zellen für diese Analyse entnommen werden müssen. Bereiten Sie Materialien und Reagenzien vor.Bereiten Sie den Waschpuffer vor, indem Sie 5 ml 5%ige BSA-Lösung und 200 μl EDTA 0,5 M bis 45 ml DPBS hinzufügen, um PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA zu erhalten. Für jede Isolierung frisch zubereiten, filtern und bis zur Verwendung im Kühlschrank aufbewahren. Beschichten Sie fluidische Chips mit Lamininlösung, die durch Verdünnung des rhLaminin 521 1:50 in DPBS Ca 2+ Mg2+ hergestellt wurde. Beschichten Sie jeden Chip mit dem für den verwendeten Chip geeigneten Volumen und inkubieren Sie ihn vor der Aussaat 2 h lang im Inkubator.HINWEIS: Andere Matrices können für die Beschichtung verwendet werden und sollten für den spezifischen Zelltyp/das spezifische Experiment getestet werden. Bereiten Sie Mix 4 SFM-34-Medium vor, indem Sie 18 ml SFM-34-Medium mit Mix-4-Zytokinen gemäß Tabelle 2 ergänzen und die Mischung in ein 50-ml-Röhrchen im Inkubator geben, wobei der Deckel leicht abgeschraubt ist, um den Gasaustausch zu erleichtern. Legen Sie die ausgewählten Perfusionssets und alle anderen zu verwendenden Schläuche zum Entgasen in den Inkubator. Tag 8 – Dissoziation von EBs und CD34+ IsolierungSammeln Sie die EBs wie in den Schritten 2.2.2.2-2.2.2.5 beschrieben. Fügen Sie 1 ml Zelldissoziationsreagenz pro Ausgangsvertiefung der gesammelten EBs hinzu (wenn 6 Vertiefungen entnommen wurden, fügen Sie 6 ml hinzu). 1 ml der EB-Suspension im Zelldissoziationsreagenz in jede Vertiefung der zellabweisenden Platte zurückgeben. 10 Minuten im Inkubator inkubieren. Pipettieren Sie die EBs vorsichtig mit einem P1000 auf und ab gegen die Vertiefung, nicht mehr als 10 Mal. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4-3.2.5 insgesamt 3x.HINWEIS: Wenn die EBs schwer zu dissoziieren sind, wiederholen Sie die obigen Schritte insgesamt 4x. Fügen Sie 5 ml Waschpuffer für jede Vertiefung dissoziierter EBs hinzu. Sammeln Sie die Zellen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, indem Sie sie durch ein 40-μm-Sieb führen. Nehmen Sie 10 μl der Zellsuspension, um die Zellen zu zählen.HINWEIS: Um die Wirksamkeit der Isolierung zu testen, werden 105 Zellen/Röhrchen in zwei verschiedene Röhrchen (ungefärbte Kontrolle und vorsortierte Testprobe) überführt, die später für die Durchflusszytometrie verwendet werden (wie in den Schritten 4.3.9-4.3.13 beschrieben). Für eine 6-Well-Platte sollten nach der Filtration ~106 Zellen gesammelt werden. Schleudern Sie die Zellen für 10 Minuten bei 300 × g herunter. Resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl Waschpuffer und pipettieren Sie sie einige Male vorsichtig, um sicherzustellen, dass keine Klumpen vorhanden sind. Befolgen Sie weiterhin das Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle). CD34+ Zell-Seeding in fluidische ChipsHINWEIS: Der im Protokoll verwendete Fluidik-Chip hat eine Kanalhöhe von 0,6 mm und eine Länge von 50 mm, was einer Gesamtwachstumsfläche von 2,5cm2 entspricht (ergänzende Abbildung S1). Diese Art von Chip wird mit einem Gesamtvolumen der Zellsuspension von 150 μl ausgesät. Es können verschiedene Chips verwendet werden, und das Volumen der Aussaat und die Zelldichte sollten entsprechend der Wachstumsfläche angepasst werden. Je nach verwendeter Zelllinie und deren Wachstum kann eine zusätzliche Optimierung erforderlich sein.Resuspendieren Sie die isolierten CD34+ -Zellen in 300 μl vorgewärmtem SFM-34-Medium mit Mix-4-Zytokinen. Nehmen Sie 10 μl der Zellsuspension und zählen Sie die Zellen. Resuspendierung von 2,5 × 105 Zellen in einem Endvolumen von 150 μl ergänztem SFM-34; 0,5 μl iRock hinzufügen.HINWEIS: Um die Wirksamkeit der Isolierung zu testen, werden 105 Zellen/Röhrchen in ein Röhrchen (nachsortierte Testprobe) überführt, das später für die Durchflusszytometrie verwendet wird (wie in den Schritten 4.3.9-4.3.13 beschrieben). Saugen Sie das Laminin langsam aus den Fluidik-Chips ab, indem Sie die Spitze eines P200 in den Behälter am Rand des Kanals stecken.HINWEIS: Wenn die Flüssigkeit schwer aufzufangen ist, heben Sie langsam eine Seite des Chips an, damit sich die Flüssigkeit in den gegenüberliegenden Behälter bewegt. Geben Sie die Zellsuspension gleichmäßig in den Kanal, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen bilden.HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.3.4-3.3.5 schnell, aber vorsichtig durch, um ein Austrocknen des Laminins und die Bildung von Blasen in den Kanälen des Chips zu vermeiden. Wenn sich Blasen bilden, heben Sie eine Seite des Chips an und klopfen Sie vorsichtig auf den Objektträger, um die Blasen zu mobilisieren. Wenn sie das Reservoir erreichen, steigen sie an die Luftschnittstelle und sollten nicht in der Lage sein, den Kanal zu mieten. Übertragen Sie den Chip in den Inkubator und lassen Sie ihn über Nacht stehen, damit die Zellen vollständig mit dem Kanal verbunden sind und länglich aussehen. Wenn die Zellen vollständig angebunden sind, saugen Sie das Medium wie in Schritt 3.3.4 an und ersetzen Sie es durch 200 μl Zytokin-ergänztes SFM-34. Tauschen Sie das Medium von nun an täglich aus, bis die Zellen eine 90%-100%ige Konfluenz erreicht haben. 4. Anwendung des kontinuierlichen Flusses auf Endothelzellen – Aorta-on-a-Chip Bereiten Sie Materialien und Reagenzien vor.Bereiten Sie Mix 4 SFM-34-Medium vor, indem Sie 18 ml SFM-34-Medium mit Mix-4-Zytokinen gemäß Tabelle 2 ergänzen und in ein 50-ml-Röhrchen im Inkubator geben, wobei der Deckel leicht abgeschraubt ist, um den Gasaustausch zu erleichtern. Legen Sie die ausgewählten Perfusionssets und alle Schläuche, die für den fluidischen Aufbau verwendet werden sollen, in den Inkubator, um sie zu entgasen. Montage von FluidiksystemenInstallieren Sie das Perfusionsset gemäß dem Protokoll des Herstellers in das Gerät.HINWEIS: Denken Sie daran, Klemmen im System zu verwenden. Wenn für diesen Schritt Schiebeklemmen verwendet werden, müssen diese vor dem Anschluss an den Chip auf den Schlauch geschoben werden. Bringen Sie einen neuen Fluidik-Chip an und fügen Sie das mit Zytokinen angereicherte SFM-34-Medium hinzu, wobei Sie sicherstellen müssen, dass beide Reservoirs unter sterilen Bedingungen in der Haube gefüllt sind. Führen Sie das Blasenentfernungsprogramm und den Kalibrierungsschritt durch. Entnehmen Sie die Fluidikeinheit mit dem angeschlossenen Set aus dem Inkubator und setzen Sie sie in die Haube um. Nehmen Sie auch die Chips mit den Zellen aus dem Inkubator. Klemmen Sie den Schlauch auf beiden Seiten des Testchips ein. Entfernen Sie den Schlauch vom Testchip.HINWEIS: Vergewissern Sie sich, dass keine Blasen im Luer-Anschluss am Ende des Schlauchs vorhanden sind. Wenn Blasen sichtbar sind, saugen Sie diese vorsichtig mit einer P200-Pipette ab und fügen Sie bei Bedarf weiteres Medium hinzu, um sicherzustellen, dass der Konnektor mit Medium gefüllt ist. Verbinden Sie den Chip, der die Zellen enthält, mit dem Schlauch. Entfernen oder öffnen Sie die Klemmen. Übertragen Sie das System in den Inkubator und schließen Sie die Luftpumpe an die Fluidikeinheit an. Starten Sie das vorgewählte Programm mit der pumpenspezifischen Software (ergänzende Abbildung S2) mit der in Tabelle 3 beschriebenen allmählichen Erhöhung der Schubspannung.HINWEIS: Abhängig von dem spezifischen Experiment, das benötigt wird, muss das Stimulationsprogramm möglicherweise optimiert werden. Hier wird ein allmählicher Anstieg der Scherspannung beschrieben, der zu einem Endwert von 5 dyn/cm2 führt, der die Scherspannung nachahmt, die berechnet wurde, um die Wand der dorsalen Aorta zu Beginn der fetalen Zirkulation zu erfahren 9. Unabhängig von der endgültigen Scherspannung, die angewendet wird, ist es notwendig, die Spannung im Laufe der Zeit allmählich zu erhöhen, damit sich die Zellen an die Kraft anpassen können, ohne dass sich die Zellen vom Chip lösen. Wenn das gewählte Stimulationsprotokoll länger als 3 Tage dauert, sollten Zytokine in das System aufgefüllt werden, indem 1 ml SFM-34 mit den Mix-4-Zytokinen hinzugefügt werden, die normalerweise in 18 ml zugegeben würden. Dazu wird das Pumpenprogramm schnell pausiert und je 500 μL supplementiertes Medium in jede der beiden Spritzen des Fluidik-Sets gegeben. Zellentnahme zur AnalyseDen Dissoziationspuffer im Wasserbad vorwärmen. Nehmen Sie die Fluidikeinheit aus dem Inkubator und setzen Sie sie in die Haube ein. Klemmen Sie den Schlauch, der den Chip flankiert, auf beiden Seiten ein und entfernen Sie den Schlauch aus den Reservoirs auf dem Chip. Entfernen Sie das Medium vorsichtig vom Chip und ersetzen Sie es durch DPBS Ca 2+ Mg2+ , um die Zellen zu waschen.HINWEIS: Dieser Schritt des Waschens mit PBS kann übersprungen werden, wenn sich die Zellen zu lösen beginnen. 150 μl Dissoziationspuffer vorsichtig zugeben und 3 min bei 37 °C inkubieren.HINWEIS: Prüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen einzeln und abgetrennt sind. Andernfalls weitere 2 Minuten inkubieren. Es ist wichtig, dass die Zellen vor dem Absaugen des Mediums vollständig vom Kanal gelöst werden, da der Chip es nicht zulässt, die Zellablösung durch Pipettieren zu unterstützen. Andere Lösungen können verwendet werden, um die Zellen abzutrennen, wie z. B. Trypsin oder EDTA-basierte Puffer. Sammeln Sie den Dissoziationspuffer, der die Zellen enthält, aus einem Reservoir und geben Sie ihn in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie den Kanal einmal mit DPBS, um alle abgelösten Zellen zu sammeln. Geben Sie 1 ml Waschpuffer in das 15-ml-Röhrchen mit den Zellen und nehmen Sie 10 μl, um die Zellen zu zählen. Teilen Sie die Zellsuspension in Durchflusszytometrieröhrchen auf, um 10bis 5 Zellen pro Reagenzglas zu erhalten. Schleudern Sie die Röhrchen 5 min bei 300 × g. Bereiten Sie die Färbelösung so vor, dass sie 50 μl für jedes zu färbende Reagenzglas enthält. CD34 PerCP-efluor710 oder CD34-PE in einer Verdünnung von 1:100 bzw. 1:200 zugeben. Die Zellen werden in 50 μl Färbelösung resuspendiert und 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 2 ml Waschpuffer und schleudern Sie sie 5 Minuten lang bei 300 × g. Resuspendieren Sie die Pellets in 100 μl Färbelösung und erfassen Sie die Daten mit einem Durchflusszytometer.HINWEIS: Die Zellen können auch direkt im Chip für die RNA-Extraktion mit 150 μl RNA-Lysepuffer lysiert oder für die Bildgebung mit 4% Paraformaldehyd in DPBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert werden. Analyse der ZellorientierungAnalysieren Sie die Bilder, um Änderungen der Zellorientierung mit FIJI23 zu quantifizieren (ergänzende Abbildung S3).Öffnen Sie den ROI-Manager (Region of Interest) über den Menüpunkt Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager-Menü . Zeichnen Sie die Zellenkonturen manuell mit dem Polygonauswahlwerkzeug , und fügen Sie sie dem ROI-Manager hinzu, indem Sie auf Hinzufügen klicken oder die Tastenkombination STRG+T verwenden. Messen Sie die Ausrichtung der einzelnen ROIs, indem Sie im Menü Analysieren | Menü “Maße festlegen” . Wenden Sie die Messung auf alle ROIs an, indem Sie Mehr… Multi-Measure-Befehl im ROI-Manager.HINWEIS: In diesem Schritt wird eine Ellipse an jede ROI angepasst und eine Tabelle generiert, die die Länge der Haupt- und Nebenellipsenachsen sowie den Winkel enthält. Exportieren Sie die Tabelle in eine CSV-Datei, um sie zum Plotten in andere Software zu importieren.HINWEIS: Das Skript, das für die Plots verwendet wird, ist unter https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf885 verfügbar.0ddc.