Выявление антител IgG и IgM к бешенству с помощью непрямого флуоресцентного теста на антитела к бешенству
Summary
Целью данной статьи является изучение использования теста на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству для выявления антител IgG и IgM, специфичных для бешенства.
Abstract
Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) был разработан для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Этот тест дает быстрые результаты и может быть использован для обнаружения антител к бешенству в нескольких различных сценариях. Тест на бешенство IFA особенно полезен для быстрого и раннего выявления антител для оценки иммунного ответа у пациента, у которого развилось бешенство. Несмотря на то, что другие методы посмертной диагностики бешенства имеют приоритет, этот тест может быть использован для демонстрации недавнего контакта с вирусом бешенства путем обнаружения антител. Тест IFA не дает титра вируснейтрализующих антител (VNA), но ответ на доконтактную профилактику (ДКП) можно оценить по положительному или отрицательному наличию антител. Этот тест может быть использован в различных ситуациях и может дать результаты для ряда различных целей. В этом исследовании мы использовали несколько парных образцов сыворотки крови людей, получавших ДКП и продемонстрировавших наличие у них антител к бешенству с течением времени с помощью теста IFA.
Introduction
Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) используется для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Это один из арсенала тестов, доступных для наблюдения за посмертным пациентом с бешенством. Это особенно полезно для раннего выявления антител для оценки иммунного ответа пациента на инфекцию бешенства. При использовании в сочетании с другими тестами, историей болезни и статусом вакцинации пациента тест IFA может помочь определить контакт с вирусом бешенства или вакциной1. Поскольку тест IFA измеряет IgM и/или IgG, значения специфических антител могут указывать на приблизительные временные рамки с момента контакта с антигеном1. Этот тест может быть полезен в перечисленных приложениях или других, которые еще не изучены.
Существует несколько серологических тестов на бешенство. Основными методами измерения нейтрализующих антител к вирусу бешенства (РВНК) являются экспресс-тест на ингибирование флуоресцентного фокуса (RFFIT), тест на нейтрализацию вируса бешенства (FAVN) или их модификации. Однако эти тесты не дифференцируют антитела IgM и IgG. Когда дифференциация изотипа антител важна для мониторинга иммунного ответа на бешенство, используются тесты на ИФА бешенства и иммуноферментный анализ на бешенство (ИФА), но они не измеряют РВНК. Несмотря на то, что тесты IFA и ELISA могут быть использованы для определения наличия антител, специфичных для бешенства, в образце существуют некоторые различия в том, как они выполняются. В тесте IFA в качестве антигенного субстрата используется живой вирус, культивируемый в клетках, в то время как типичный ИФА для выявления бешенства использует один или несколько вирусных белков. В лабораторных условиях, где вирус бешенства может быть культивирован, тест IFA может быть более простым вместо покупки или культивирования отдельных вирусных белков для ИФА. Цель тестирования и информация, полученная из результатов любого серологического анализа на бешенство, должны учитываться при принятии решения о том, какой из нихвыбрать.
IgM реагирует первым, увеличиваясь до тех пор, пока не будет наблюдаться смена класса примерно на 28-й день, после чего IgG становится преобладающим циркулирующим антителом3. Следовательно, IgM можно ожидать только в течение ограниченного периода времени после контакта с вирусом бешенства или вакцинации. Тестирование как сыворотки, так и спинномозговой жидкости (ликвора) может показать, был ли контакт через вакцинацию, при которой антитела будут видны только в сыворотке, или от вирусной инфекции, которая потенциально может показать антитела в спинномозговой жидкости1.
Установлено, что антитела к бешенству сохраняются в течение нескольких лет после доконтактной профилактики (ДКП)4. Тест IFA может быть полезным инструментом, чтобы продемонстрировать это в различные моменты времени после вакцинации или контакта.
Protocol
Representative Results
Discussion
В тесте IFA используется комплекс антиген-антитело, позволяющий визуализировать антитела, специфичные для бешенства. Клетки нейробластомы или BHK высевают на предметные стекла микроскопа с многолуночным покрытием из ПТФЭ и инокулируют лабораторным штаммом вируса бешенства CVS-11. После т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Центру Уодсворта Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк за поддержку этого проекта.
Materials
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well Teflon coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500 or 6500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
References
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. . Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
