Summary

Nachweis von Tollwut-IgG- und IgM-Antikörpern mit dem Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Tollwut-Antikörpern

Published: January 19, 2024
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Summary

Ziel dieses Manuskripts ist es, den Einsatz des indirekten Fluoreszenz-Antikörpertests für Tollwut zum Nachweis von tollwutspezifischen IgG- und IgM-Antikörpern zu untersuchen.

Abstract

Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) wurde entwickelt, um verschiedene tollwutspezifische Antikörper-Isotypen in Seren oder Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit nachzuweisen. Dieser Test liefert schnelle Ergebnisse und kann zum Nachweis von Tollwut-Antikörpern in verschiedenen Szenarien verwendet werden. Der Tollwut-IFA-Test ist besonders nützlich für den schnellen und frühen Nachweis von Antikörpern, um die Immunantwort bei einem Patienten, der an Tollwut erkrankt ist, zu bewerten. Obwohl andere Methoden zur antemortalen Tollwutdiagnostik Vorrang haben, kann dieser Test verwendet werden, um eine kürzliche Exposition gegenüber dem Tollwutvirus durch Antikörpernachweis nachzuweisen. Der IFA-Test liefert keinen virusneutralisierenden Antikörpertiter (VNA), aber die Reaktion auf die Präexpositionsprophylaxe (PrEP) kann durch positives oder negatives Antikörpervorhandensein bewertet werden. Dieser Test kann in verschiedenen Situationen eingesetzt werden und Ergebnisse für eine Reihe verschiedener Ziele liefern. In dieser Studie verwendeten wir mehrere gepaarte Serumproben von Personen, die PrEP erhielten und ihre Tollwut-Antikörperpräsenz im Laufe der Zeit mit dem IFA-Test nachweisen konnten.

Introduction

Der Tollwut-Test mit indirekten fluoreszierenden Antikörpern (IFA) dient zum Nachweis verschiedener tollwutspezifischer Antikörper-Isotypen in Seren oder im Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit. Er gehört zu einem Arsenal von Tests, die für die Überwachung eines antemortalen Tollwutpatienten zur Verfügung stehen. Es ist besonders nützlich für die Früherkennung von Antikörpern, um die Immunantwort eines Patienten auf eine Tollwutinfektion zu bewerten. In Verbindung mit anderen Tests, der Anamnese und dem Impfstatus des Patienten kann der IFA-Test bei der Bestimmung der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einem Impfstoff helfen1. Da der IFA-Test IgM und/oder IgG misst, können die Werte des spezifischen Antikörpers einen ungefähren Zeitrahmen von der Exposition gegenüber dem Antigen1 anzeigen. Dieser Test kann in den aufgeführten Anwendungen oder anderen, die noch nicht untersucht wurden, nützlich sein.

Es stehen mehrere serologische Tollwuttests zur Verfügung. Der Fluoreszenz-Fokus-Inhibitions-Schnelltest (RFFIT), der Fluoreszenz-Antikörper-Virus-Neutralisationstest (FAVN) oder deren Modifikationen sind die primären Methoden zur Messung von Tollwutvirus-neutralisierenden Antikörpern (RVNAs)1. Diese Tests unterscheiden jedoch nicht zwischen IgM- und IgG-Antikörpern. Wenn die Differenzierung des Antikörper-Isotyps für die Überwachung der Tollwut-Immunantwort wichtig ist, werden die Tollwut-IFA- und die Tollwut-ELISA-Tests (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) verwendet, die jedoch keine RVNAs messen. Obwohl die IFA- und ELISA-Tests verwendet werden können, um das Vorhandensein von tollwutspezifischen Antikörpern in einer Probe zu bestimmen, gibt es einige Unterschiede in der Art und Weise, wie sie durchgeführt werden. Der IFA-Test verwendet ein zellkultiviertes lebendes Virus als Antigensubstrat, während ein typischer ELISA für den Tollwutnachweis eines oder mehrere der viralen Proteine verwendet. In einer Laborumgebung, in der das Tollwutvirus kultiviert werden kann, kann der IFA-Test einfacher durchgeführt werden, anstatt einzelne virale Proteine für den ELISA zu kaufen oder zu kultivieren. Der Zweck der Untersuchung und die Informationen, die aus den Ergebnissen eines serologischen Tollwuttests gewonnen werden, sollten bei der Entscheidung berücksichtigt werden, welche zu wählenist 2.

IgM reagiert zuerst und steigt an, bis etwa am 28. Tag ein Klassenwechsel beobachtet wird, an dem IgG zum vorherrschenden zirkulierenden Antikörperwird 3. Daher wäre IgM nur für einen begrenzten Zeitraum nach der Exposition gegenüber dem Tollwutvirus oder einer Impfung zu erwarten. Die Untersuchung von Serum und Liquor cerebrospinalis (CSF) kann darauf hinweisen, ob die Exposition durch eine Impfung erfolgte, bei der Antikörper nur in Seren zu sehen sind, oder durch eine Virusinfektion, die möglicherweise Antikörper im Liquor1 aufweisen würde.

Es wurde festgestellt, dass Tollwut-Antikörper nach einer Präexpositionsprophylaxe (PrEP) mehrere Jahre persistieren4. Der IFA-Test kann ein nützliches Instrument sein, um dies zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Impfung oder Exposition nachzuweisen.

Protocol

Das folgende Protokoll wurde vom Wadsworth Center des New York State Department of Health für die Entwicklung von Assays für die ethische Verwendung von menschlichen Proben genehmigt, Protokollgenehmigungsnummer #03-019. 1. Sicherheit Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), mindestens Augenschutz (Brille oder Gesichtsschutz), eine chirurgische Maske und latexfreie Handschuhe. Stellen Sie sicher, dass das Personal gegen Tollwut geimpft ist und das…

Representative Results

Alle Serumproben wurden den Patienten in etwa gleichen Zeiträumen nach der PrEP entnommen. Die Proben wurden von fünf verschiedenen Patienten zu folgenden Zeitpunkten getestet: 2 Wochen nach der letzten Tollwutimpfung, 6 Monate nach der Tollwutimpfserie und 18 Monate nach der Tollwutimpfserie. Jede Serumprobe wurde nacheinander verdünnt und sowohl für das Vorhandensein von IgM als auch für IgG eingestuft, wie in den Protokollschritten 5.2 und 5.3 beschrieben. Der zugewiesene Antikörperwert stellt den Verdünnungsfa…

Discussion

Der IFA-Test nutzt einen Antigen-Antikörper-Komplex, der eine Markierungsstelle zur Visualisierung tollwutspezifischer Antikörper ermöglicht. Neuroblastom- oder BHK-Zellen werden auf PTFE-beschichtete Objektträger mit mehreren Wells gesetzt und mit dem Tollwutvirus-Laborstamm CVS-11 inokuliert. Sobald die Monoschicht konfluiert ist und die Zellen die gewünschte Infektiosität von ca. 50 % erreicht haben, werden die Objektträger bis zur Gebrauchsbereitschaft gelagert6.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem Wadsworth Center des New York State Department of Health für die Unterstützung dieses Projekts.

Materials

25x55mm glass cover slips Any
Acetone Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate Sigma-Aldrich F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate SeraCare 5230-0286
Aspirating pipette tip Any
BHK-21 Cells ATCC CCL-10
BION IFA Diluent MBL BION DIL-9993
Cell Culture water Sigma-Aldrich W3500 EGM
Coplin Jars Any
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F2442 EGM
Fluorescent microscope with FITC filter Any
Glycerol Sigma-Aldrich G7893 Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent Fisher Scientific 23-043-158 IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine Sigma-Aldrich G-7513 EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate Sigma-Aldrich M0643 EGM
Mouse Neuroblastoma Cells ATCC CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides Any
PBS Any pH 7.6 
Penicillin Sigma P-3032 EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate Millipore Sigma 5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761 EGM
Sodium Chloride crystals Sigma-Aldrich S5886 Mountant
Sterile dropper Any
Streptomycin sulfate salt Sigma S9137 EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0 Sigma-Aldrich S9693 Mountant
Tryptose Phosphate Broth BD 260300 EGM
Vitamin mix Sigma-Aldrich M6895 EGM

References

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Cite This Article
Jones, N. J., Jarvis, J. A., Appler, K. A., Davis, A. D. Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test. J. Vis. Exp. (203), e65459, doi:10.3791/65459 (2024).

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