파킨슨병 모델에서 미토콘드리아 형태학의 조직학적 검사

이 섹션에 설명된 모든 절차는 바스크 대학교 참조 M20/2022/212, 바스크 지방 정부, 스페인 정부 및 유럽 연합에서 제공한 윤리 프레임워크에 따라 수행되었습니다. 1. SNCA 과발현 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 형태 분석 참고: 여기에서는 연구를 위한 시험관 내 물질의 생성에 대한 간략한 설명이 제공되며, 이는 현장에서 얻은 결과를 비교하는 역할을 합니다. 이러한 유형의 분석은 미토콘드리아 형태에 대한 생체 내 실험을 시작하기 전에 수행하는 것이 좋으며, 이는 모든 적절한 이미징 및 분석 설정이 제자리에 있는지 확인하기 때문입니다. 평평한 광학 바닥 96웰 플레이트에서 세포 부착을 증가시키고 세포 접착을 촉진하려면 피펫팅을 통해 DMEM F12에 코팅 매트릭스 1:1000의 25μL/웰을 추가합니다( 재료 표 참조). 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO2 에서 1 시간 동안 배양합니다. Neubauer 챔버를 사용하여 SH-SY5Y를 계산합니다. 피펫팅으로 코팅 매트릭스를 제거하고 10% FBS, 2mM 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM F-12의 50μL/웰에 코팅된 96웰 플레이트에 10.000세포/웰을 파종합니다( 재료 표 참조). 세포를 37 °C 및 5 % CO2에서 24 시간 동안 배양합니다. 인간 야생형 SNCA를 운반하는 pcDNA3.1 250ng, transfection 시약 0.250μL, transfection adjuvant 0.250L, 각 웰에 대해 최대 50μL의 transfection 배지를 혼합물로 준비합니다( 재료 표 참조). 실험의 총 웰 수를 고려하여 마스터 솔루션을 준비합니다. 수동 피펫팅으로 배양 배지를 제거하고 피펫팅을 통해 1.4단계에서 준비한 용액 50μL/웰을 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 배양합니다. h 형질주입 후 피펫팅을 통해 형질주입 배지를 제거하고 PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)의 25μL/웰을 추가합니다.주의: 파라포름알데히드는 독성 고정제입니다. 적절한 PPE를 사용하십시오. 실온(R.T)에서 5분간 배양합니다. 피펫팅으로 정착액을 제거하고 50μL/웰의 PBS를 추가하여 한 번 세척합니다. 파이펫팅을 통해 PBS를 제거합니다. 0.05% 트윈(TBS-T) 및 10% 일반 당나귀 혈청(NDS, 재료 표 참조)이 포함된 TBS 25μL/웰 피펫. 불특정 신호를 차단하기 위해 R.T.에서 1시간 동안 배양합니다. 분석할 웰의 수에 따라 TBS-T에서 Mouse-anti-α-synuclein 항체 MJFR1 1:1000과 Mouse-anti-TOMM20 항체 1:100의 용액을 준비합니다( 재료 표 참조). 피펫팅을 통해 1.8단계에서 차단 용액을 제거하고 1.9단계에서 준비한 1차 항체 혼합물 25μL/웰을 추가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1차 항체 용액을 제거하고 피펫팅으로 TBS-T 50μL/웰을 추가 및 제거하여 3회 세척합니다. 분석할 웰의 수에 따라 TBS-T( 재료 표 참조)에서 녹색 2차 항체 항-Mouse 1:1000과 적색 2차 항체 항-Rabbit 1:1000의 용액을 준비합니다. 단계 1.11에 기술된 마지막 세척에서 PBS를 흡인한 후, 피펫을 사용하여 2차 항체 혼합물 25μL/웰을 첨가하고 R.T.에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 피펫팅을 통해 2차 항체 용액을 제거하고 TBS-T에 2g/mL DIPI의 25μL/웰을 추가합니다. R.T.에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다. 피펫을 사용하여 DAPI 용액을 제거하고 피펫으로 TBS-T 50μL/웰을 추가 및 제거하여 3회 세척합니다. PBS 80μL/웰을 0.02% 아지드화나트륨으로 피펫팅하고 플레이트를 4°C에서 보관합니다.주의 : 아지드 나트륨은 독성이 있습니다. 적절한 PPE를 사용하십시오. High-Content 자동 형광 현미경 또는 60x 대물렌즈가 장착된 동등한 컨포칼 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조). 20-3.15단계에 따라 Fiji를 사용하여 단일 셀의 TOMM3.21 신호 분석을 수행합니다. 세포사멸, 괴사 또는 유사분열을 겪는 세포를 피하십시오.참고: 이를 위해 세포 수축, 막 번짐, 세포 분리, 핵 응축, DNA 단편화 및 단일 평면에 정렬된 두꺼운 가닥으로 조직된 응축된 핵 크로마틴과 같이 현미경으로 볼 수 있는 세포 사멸, 괴사 또는 유사분열의 형태학적 특징을 보여주는 세포를 분석에서 제외합니다. 2. 마우스에서 PFF 및 PFF 두개내 주사의 생성 참고: 주입 재료의 생성과 두개내 주입 과정이 여기에 제시되어 있습니다. 이 프로토콜은 Luk et al.25에서 채택되었습니다. PFF를 얻으려면 0.5mL의 α-Syn(5mg/mL; 펩타이드, 재료 표 참조) 37 °C 및 250 rpm에서 7 일 동안 셰이커에서 α-synuclein의 응집을 유도합니다. 최적의 단편화가 달성되고 투과 전자 현미경으로 샘플의 음성 염색에 의해 관찰 될 때까지 20 % 진폭 및 0.25 사이클 듀티에서 집계 된 α- 시누클레인을 초음파 처리합니다. 선조체 PFF 주사를 위해 수컷 및 암컷 야생형 C57Bl/6 마우스(3개월령)를 준비하기 위해 Meloxicam/Metacam(5mg/kg)을 식염수에 피하 투여합니다. 또한 동물당 0.5mL 피하 주사 2회 를 통해 멸균 식염수 1mL를 투여합니다. 이러한 치료법은 탈수, 염증 및 통증을 예방한다. 유도 챔버에서 4% 이소플루란과 0.7L/minO2 로 마취를 유도합니다. 페달 반응의 부족으로 마취 깊이를 확인하십시오. 마우스 머리의 윗부분을 면도하고 열 매트의 정위 장치 프레임에 동물을 부드럽게 삽입합니다. 전체 주입 과정에서 안면 마스크를 통해 동물 흡입 마취(0.7L/min O2의 1%-2% 이소플루란)를 제공하여 마취면을 유지합니다. 동물을 정위 프레임에 놓습니다. 클로르헥시딘 스크럽과 70% 에탄올을 번갈아 가며 3회 사용하여 수술 부위를 소독합니다. 마르케인/부피바카인을 국소적으로(약 100μL) 0.25%의 피하 침윤으로 도포합니다. 피부를 0.5cm 절개하여 두개골을 노출시키고 두개골에 직경 1mm의 구멍을 뚫어 뇌 표면을 노출시킵니다. – 0.5mm 전후방, +/- 2.5mm 내측. 2.2단계에서 얻은 PFF 1.5L를 32G Hamilton 주사기로 100nl/min의 유속으로 Bregma에서 2.8단계와 -2.7mm 배쪽(상부 뇌에서)에 표시된 좌표에 정위 전달하여 주입합니다. 주사 후 5분 후에 주사기를 빼냅니다. 봉합사 (크기 : 4-0, 45cm, 재료 표 참조)는 필요에 따라 3-5 바늘로 상처를 꿰매고 각각 2 개의 이중 매듭으로 결합 한 다음 단일 매듭으로 결합합니다. 마취제 흡입을 중지하고 프레임에서 마우스를 제거합니다. 마우스를 홈 케이지로 되돌리기 전에 적절한 복구 케이지에서 회복하도록 두십시오. 그 다음 주에는 매일 수술 후 점검을 실시하십시오. 모든 동물의 통증, 고통 또는 불편함은 24시간마다 2.3단계에 표시된 대로 Meloxicam/Metacam을 투여해야 합니다. 3개월 후, 복강 내 주사를 통해 식염수에 펜토바르비탈 나트륨 200mg/mL 300μL를 주입합니다. 통증 반사가 사라지면 가슴을 절개(2-3cm)하고 갈비뼈를 들어 올려 심장을 노출시킵니다. 23G 나비 바늘에 연결된 50mL 주사기를 사용하여 5mL/분에서 PBS에서 10mL의 PBS와 35mL의 4% 파라포름알데히드를 차례로 심 관류합니다. 뇌를 제거하고 4 ° C에서 24 시간 동안 4 % PFA에 포스트 픽스를 넣습니다. PFA 처리 후 4°C에서 70% 에탄올에 보관하십시오. 뇌를 적절한 플라스틱 임베딩 상자( 재료 표 참조)에 넣고 R.T.에서 95% 에탄올에서 1시간 동안 배양합니다. 신선한 95% 에탄올에서 단계를 반복하고 1시간 동안 다시 배양합니다. R.T.에서 1시간 동안 뇌를 100% 에탄올로 옮기고 신선한 100% 에탄올로 단계를 반복하고 1시간 동안 다시 배양합니다. 뇌를 자일렌 또는 자일렌으로 옮기고 R.T.에서 1시간 동안 대체합니다. 신선한 용액에서 반복하고 1시간 동안 다시 배양합니다. 크실렌 또는 크실렌 대체품을 제거하고 샘플을 따뜻한 파라핀에서 1시간 동안 배양합니다. 파라핀을 교체하고 한 시간 더 배양합니다. 따뜻한 파라핀으로 뇌를 임베딩 박스에 장착하고 밤새 말리십시오. 마이크로톰( 재료 표 참조)을 사용하여 5μm 절편을 준비하고 유리 슬라이드에 장착합니다. 3. PFF 주입 마우스의 파라핀 포매 뇌 절편에 대한 면역조직화학에 의한 미토콘드리아 형태 분석 슬라이드를 크실렌 대용품에 10번 담가 왁스를 제거합니다. 슬라이드를 자일렌 대용품에서 2분 동안 배양합니다. 크실렌 대용품에 다시 10번 담그십시오.참고: 이 단계는 파라핀을 제거하고 샘플의 재수화를 활성화하는 데 필요합니다. 재수화: 100% EtOH, 95% EtOH, 70% EtOH 용액으로 3.1단계에서 설명한 절차를 반복하고 ddH2O를 순서대로 두 번 반복합니다. 아래 단계에 따라 항원 회수 및 면역염색을 수행합니다.먼저 샘플을 ddH2O가 있는 전자레인지용 용기에 옮깁니다. 4°C에서 보관된 100x 구연산염 완충액 pH 6( 재료 표 참조)을 예열하고(세제가 침전되었을 수 있음) 신선한 1x 구연산염 완충액 350mL를 준비합니다. 그런 다음 구연산염 완충액을 뚜껑이 있는 편리한 플라스틱 용기에 붓습니다. 슬라이드를 구연산염 버퍼 용기에 넣고(중요: 슬라이드가 버퍼 수준 아래에 있는지 확인) 뚜껑을 덮습니다.주의 : 뚜껑이 완전히 닫히지 않았는지 확인하십시오., 그렇지 않으면 용기가 전자레인지에서 터질 수 있습니다. 700W에서 전자레인지: 4분 + 5분 휴식, 1.5분 + 5분 휴식. 구연산염 완충액을 보충하고 전자레인지에 다시 1.5분 + 5분 휴식, 1.5분 + 5분 휴식, 1.5분 + 5분 휴식. 얼음 위의 구연산염 완충액에 있는 샘플을 20분 동안 식힙니다. ddH2O로 샘플을 세척합니다.참고: 항원 검색은 특정 항체 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다. 조직을 만지지 않고 종이 타월로 샘플 슬라이드를 건조시킵니다. 티슈 조각 주위에 pap 펜( 재료 표 참조)으로 직사각형을 그립니다. 모든 슬라이드를 슬라이드 면역 염색 상자에 옮기고 TBS + 0.05% 트윈(TBS-T)으로 부드럽게 몇 번 세척합니다. TBS-T 방울이 pap-pen 사각형 안에 있는지 확인하십시오. 종이 타월을 두드려 샘플에서 TBS-T를 제거합니다. 50μL의 차단 용액(TBS-T의 경우 10% NDS)을 각 직사각형(조직을 건드리지 않고)에 넣고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.알림: 볼륨은 조직의 크기에 따라 다를 수 있습니다. (1) PAP-penned 영역이 샘플 간에 유사하고 (2) 영역이 선택한 버퍼 부피로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 종이 타월을 두드려 샘플에서 차단 용액을 제거합니다. TBS-T: 항-티로신 하이드록실라제 1:250과 항-VDAC1 1:100 및 항-pSer129 α-시누클레인 EP1536Y 1:2000의 1차 항체 혼합물을 50μL/직사각형으로 부드럽게 피펫팅합니다( 재료 표 참조). 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 슬라이드에 TBS-T를 피펫팅하여 세척하고 종이 타월을 두드려 제거합니다. 세 번 반복합니다. TBS-T에서 녹색 2차 항 닭, 적색 2차 항 마우스 및 원적색 2차 항 토끼 1:1000의 2차 항체 혼합물 50μL/직사각형을 피펫팅하여 추가합니다( 재료 표 참조). 어두운 곳에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 3.13단계에서 설명한 대로 TBS-T로 세 번 세척합니다. TBS-T에서 DAPI 2 μg/mL로 1분 동안 배양합니다. 종이 타월을 두드려 DAPI 솔루션을 제거합니다. 3.13단계에서 설명한 대로 TBS-T로 세 번 세척합니다. 장착 시약의 슬라이드당 2방울을 사용하여 샘플에 유리 커버슬립을 장착합니다( 재료 표 참조). 커버슬립을 부드럽게 눌러 기포를 제거하고 샘플을 R.T.에서 1시간 동안 건조시킨 후 어두운 곳에서 4°C에서 보관합니다. 60x 오일 대물렌즈 또는 컨포칼 기술이 장착된 구조화된 조명 형광 이미징 시스템을 사용하여 다양한 분야에서 최소 50개의 세포를 이미징합니다. 다음 단계에 표시된 대로 Fiji를 사용하여 단일 셀의 VDAC1 신호 분석을 수행합니다.먼저 양수 또는 음수 셀 주위에 등고선을 그리고(적절한 경우) “자르기” 기능을 사용하여 관심 영역(ROI) 을 선택하고 분리합니다. ROI 선택의 편향을 피하려면 분석과 관련이 없는 마커(즉, 미토콘드리아 마커가 아님)의 형광 신호를 고려하여 선택합니다. 선택 사항: 이미지가 과도하게 픽셀화된 경우 “부드럽게” 기능을 사용하여 더 높은 가장자리 선명도를 얻습니다.참고: 스무스 기능을 이미지에 적용하는 경우 이후의 모든 이미지에 적용하십시오. 선택 사항: “Convolve” 기능( 프로세스 > 필터의 커널 모드)을 사용하여 배경을 줄입니다.알림: 이것은 선택 사항이며 섹션의 얇은 특성으로 인해 5m 섹션을 사용할 때는 일반적으로 필요하지 않습니다. 형상 설명자를 활성화하고 “측정 설정” 기능에서 임계값 옵션을 제한합니다(분석을 통해 활성화되었는지 확인). “조정” 메뉴에서 임계값 기능을 선택하고 임계값 수준을 조정합니다. 동일한 샘플의 모든 셀에 대해 임계값 설정을 유지해야 합니다.이 기사의 대표 이미지에 표시된 것처럼 미토콘드리아 네트워크의 적절한 시각화를 보장하면서 배경 픽셀을 버리십시오. 분석 탭의 파티클 분석 도구를 사용합니다. 미토콘드리아를 포착하기 위해 적절한 크기를 설정합니다. 이 예제에서는 size: 25-Infinity, activate: Pixel units, Show: Masks 명령을 선택하여 결과를 시각화했습니다. Fiji는 개수, 종횡비(AR) 및 기타 형상 매개변수를 계산하여 새 패널에 표시합니다. 데이터에 대한 통계 분석을 적절하게 수행합니다. 이 실험에서 t-검정은 D’Agostino 및 Pearson 정규성 검정을 사용한 정규성 검정 후 피지에서 실험 그룹 간에 계산한 평균 종횡비(AR) 및 개수의 차이를 분석하는 데 사용되었습니다.