Geoptimaliseerde productie en analyse van recombinante met eiwitten gevulde blaasjes van E. coli

Het uitgevoerde bacteriële werk volgt de lokale, nationale en internationale voorschriften voor de inperking van de bioveiligheid die passen bij het specifieke bioveiligheidsrisiconiveau van elke stam. 1. Selectie van verschillende VNps Identificeer de VNp-sequenties.OPMERKING: Voor deze studie zijn drie VNp-sequenties geïdentificeerd1 die resulteren in maximale opbrengst en vesiculaire export van de tot nu toe onderzochte eiwitten: VNp2, VNp6 en VNp15. Het is op dit moment niet duidelijk waarom bepaalde VNp-varianten met sommige eiwitten efficiënter presteren dan andere; daarom wordt aanbevolen dat fusies worden gegenereerd tussen een nieuw eiwit van belang met elke VNp-variant (d.w.z. VNp2, 6 of 15).VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLVNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEPlasmiden die expressie van het eiwit van belang met verschillende VNp amino terminale fusies mogelijk maken, zijn commercieel beschikbaar gesteld (zie tabel met materialen). Ontwerp een kloonstrategie om het gen van belang in te voegen aan het 3′-uiteinde van het cDNA-dat codeert voor de VNp in een van deze constructen, of pas een bestaand plasmide aan door gesynthetiseerd VNp cDNA stroomopwaarts van het eerste ATG-codon van het gen dat codeert voor het eiwit van belang te integreren. Gebruik de methoden zoals beschreven in1. Gebruik voor toxische eiwitten een vector met een onderdrukkende expressiebevorderaar of een promotor met minimale niet-geïnduceerde expressieruis. Kloon de VNp-sequentietag op de amino-terminal van het fusie-eiwit. Zorg ervoor dat de affiniteitstags, proteassplitsingssequenties, enz., En het eiwit van belang zich aan de carboxylzijde van de VNp-tag bevinden. Het wordt aanbevolen om de VNp te scheiden van het stroomafwaartse peptide met een flexibel linkergebied, zoals twee of drie herhalingen van een -G-G-S-G- polypeptidesequentie (figuur 1).OPMERKING: Gebruik plasmiden met een antibioticaselectie die zich niet richt op peptidoglycaan, wat het celoppervlak verzwakt en de blaasjesopbrengst vermindert. Kanamycine en chlooramfenicol (zie tabel met materialen) waren de voorkeursantibiotica die voor deze studie werden gebruikt. 2. Bacteriële celkweek en eiwitinductie OPMERKING: Bacteriestammen die meestal in dit protocol worden gebruikt, zijn Escherichia coli BL21 (DE3) of W3110. E. coli-cellen worden gekweekt in lysogene bouillon (LB) (10 g/L trypton; 10 g/L NaCl; 5 g/L gistextract) of geweldige bouillon (TB) (12 g/L trypton; 24 g/L gistextract; 4 ml/l 10% glycerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, zouten afzonderlijk geautoclaveerd) media (zie materiaaltabel). Voorbeeldafbeeldingen van elke stap van de eiwitinductie en het daaropvolgende isolatie- en zuiveringsproces zijn weergegeven in figuur 2. Kweek 5 ml LB-starters van verse bacteriële transformaties bij 37 °C tot verzadiging en gebruik ze om 25 ml tbc te enten in een erlenmeyer van 500 ml, allemaal met de juiste antibioticaselectie. De oppervlakte:volumeverhouding is een belangrijke factor bij het optimaliseren van dit systeem. Gebruik een zo groot mogelijke volumekolf (bijv. 5 l kolf met 1 l cultuur; gebruik voor optimalisatieruns 25 ml media in een kolf van 500 ml). Incubeer de grotere schudkolfculturen in een incubator bij 37 °C met schudden bij 200 tpm (≥25 mm omslagworp) totdat een optische dichtheidswaarde van 600 nm (OD600) van 0,8-1,0 is bereikt.OPMERKING: Vesiculatie is optimaal wanneer cellen worden gekweekt bij 37 °C. Sommige recombinante eiwitten vereisen echter expressie bij lagere temperaturen. Als dit het geval is voor het eiwit van belang, moet de VNp6-tag worden gebruikt, omdat dit de export van blaasjes met een hoog rendement mogelijk maakt bij temperaturen tot 25 °C. Om recombinante eiwitexpressie van de T7-promotor te induceren, voegt u isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe tot een eindconcentratie van maximaal 20 μg / ml (84 μM) (zie materiaaltabel). De inductie van recombinante eiwitexpressie moet plaatsvinden in de late logfase (d.w.z. typisch OD600 van 0,8-1,0) voor de productie van blaasjes.OPMERKING: De lengte van de inductieperiode kan verschillen tussen eiwitten, waarbij sommige de maximale productie bereiken na 4 uur en andere ‘s nachts (18 uur). Tot op heden is maximale blaasjesexport verkregen in nachtculturen. 3. Recombinante vesikelisolatie Pellet de cellen door centrifugeren bij 3.000 x g (4 °C) gedurende 20 minuten. Om vesikelbevattende media te steriliseren voor langdurige opslag, voert u de geklaarde kweekmedia door een steriel en reinigingsmiddelvrij 0,45 μm polyethersulfon (PES) filter (zie materiaaltabel).OPMERKING: Om de uitsluiting van levensvatbare cellen van het vesikelbevattende filtraat te testen, plaat op LB-agar en incubeer ‘s nachts bij 37 °C. Om blaasjes in een kleiner volume te concentreren, voert u de steriele blaasjesbevattende media door een steriel en reinigingsmiddelvrij 0,1 μm gemengde cellulose-esters (MCE) -filter (zie materiaaltabel). Was het membraan voorzichtig met 0,5-1 ml steriele PBS met behulp van een celschraper of plastic strooier om voorzichtig blaasjes van het membraan te verwijderen. Breng over in een verse microfugebuis.OPMERKING: Gezuiverde blaasjes kunnen worden bewaard in steriele media of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 °C. Er zijn voorbeelden van recombinante eiwitten die gedurende 6 maanden in deze blaasjes zijn opgeslagen, op deze manier, zonder verlies van enzymatische activiteit. 4. Oplosbare eiwitafgifte uit geïsoleerde blaasjes Zodra eiwitbevattende blaasjes zijn geïsoleerd in de steriele media / buffer, onderwerpt u vesiculaire lipidemembranen aan ultrasoonapparaat met behulp van een geschikt schema voor het apparaat (bijv. 6x 20 s aan en uit cycli) en centrifugeert u gedurende 20 minuten bij 39.000 x g (4 ° C) om blaasjesresten te verwijderen.OPMERKING: Osmotische shock of behandeling met reinigingsmiddelen kan worden gebruikt als alternatief om de blaasjes open te breken, maar er moet rekening worden gehouden met de impact op de eiwitfunctionaliteit en / of downstream-toepassing. Als VNp-fusie cytosolisch blijft en niet in de media vrijkomt, isoleer het eiwit dan met behulp van standaardprotocollen (bijv. Resuspendeer de celpellets in 5 ml van een geschikte extractiebuffer (20 mM tris, 500 mM NaCl), soniceer en verwijder het celafval door centrifugatie). 5. Bepaling van de eiwitconcentratie Bepaal de concentratie van eiwitten door geldensitometrieanalyse van drievoudige monsters1. Voer naast runderserumalbumine (BSA) laadnormen uit op coomassie-gekleurde natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) gels. Scan en analyseer de gels met behulp van de juiste software (bijv. Afbeelding J; zie Materiaaltabel). 6. Visualisatie van blaasjesvorming en geïsoleerde blaasjes door fluorescentiemicroscopie OPMERKING: Als de cellen fluorescerend gelabelde VNp-fusie of membraanmarkers bevatten, kan live cell imaging worden gebruikt om de vorming van blaasjes te volgen. Als alternatief kunnen fluorescerende lipidekleurstoffen worden gebruikt om blaasjes te visualiseren om de productie en zuivering te bevestigen. CelmontageInduceer VNp-fusie-expressie gedurende enkele uren voordat u deze op de afdekplaat monteert. Agarose pad-methode (figuur 3A-C): pipetteer de cellen op een dunne (<1 mm), cirkelvormige LB-agarose (2%) pad die zich heeft kunnen vormen en op een schone glasplaat is geplaatst. Laat de cellen bezinken en balanceren en plaats een coverslip van 50 mm x 25 mm op de pad en cellen. Houd de coverslip op zijn plaats met afstandhouders en plakband. Polyethyleenimine (PEI) methode (figuur 3D-F): verdeel 20 μL van 0,05% PEI (in dH2O) op een dekplaat met een pipetpunt en laat 3-5 minuten binden aan glas zonder te laten drogen. Voeg 50 μL celkweek toe en laat 5-10 minuten staan om er zeker van te zijn dat bacteriën zich hebben geassocieerd met het PEI-gecoate oppervlak4. Was de coverslip met 100 μL media voordat u deze op de dia plaatst en houd deze op zijn plaats met afstandhouders en plakband. MontageblaasjesPipet gezuiverde blaasjes op een dunne (<1 mm), ronde LB-agarose (2%) pad dat is toegestaan om te vormen en te zetten op een schone glazen dia. Zodra de vloeistof is opgedroogd, plaatst u een afdekplaat van 50 mm x 25 mm op de pad en blaasjes. Houd de coverslip op zijn plaats met afstandhouders en plakband. De fluorescerende lipidekleurstof FM4-64 is in staat om membranen5 te kleuren en kan daarom worden gebruikt om blaasjes te visualiseren. Voeg FM4-64 (zie materiaaltabel) toe aan gezuiverde blaasjes in een eindconcentratie van 2 μM (uit een voorraad van 2 mM opgelost in dimethylsulfoxide [DMSO]) en beeld na een incubatie van 10 minuten. Dit is vooral handig voor het identificeren van blaasjes met niet-fluorescerend gelabelde ladingen5. Spoel de coverslips af met dezelfde media die worden gebruikt om de waargenomen cellen te kweken.OPMERKING: Sommige complexe media (bijv. TB) kunnen autofluorescentie vertonen, wat kan leiden tot een teveel aan achtergrondsignaal. BeeldblaasjesOPMERKING: Voorbeeldmicroscopiebeelden van VNp-recombinante blaasjes zijn te zien in figuur 4.Monteer de dia op een omgekeerde microscoop (zie materiaaltabel) met behulp van een olie-onderdompelingsobjectief en laat 2-3 minuten staan om het monster te laten bezinken en de temperatuur in evenwicht te brengen.OPMERKING: Alle beelden van levende cellen voor elk monster moeten binnen 30 minuten na montage van cellen op dekstroken worden voltooid om de impact van fototoxiciteit en anaerobe stress te minimaliseren. Om deze reden hebben single-plane afbeeldingen de voorkeur boven z-stacks. Gebruik geschikte lichtbronnen (bijv. light emitting diode [LED] of halogeenlamp; zie materiaaltabel) en filtercombinaties voor de gebruikte fluorescerende eiwitten / kleurstof(fen)6. Gebruik een hoge vergroting (d.w.z. 100x of 150x) en een hoog numeriek diafragma (d.w.z. NA ≥1.4) lens voor het in beeld brengen van de microbiële cellen en blaasjes. Bepaal de minimale lichtintensiteit die nodig is om fluorescentiesignalen van cellen en / of blaasjes te visualiseren. Dit kan enige aanpassing van de belichtings- en versterkingsinstellingen voor de gebruikte camera vereisen.OPMERKING: Typische belichtingstijden van de huidige complementaire metaaloxide halfgeleider (CMOS) camera’s variëren tussen 50-200 ms, afhankelijk van het beeldvormingssysteem. Voor afbeeldingen met één frame gebruikt u gemiddelde van drie afbeeldingen om hardwareafhankelijke willekeurige achtergrondruis te verminderen. Voor time-lapse-beeldvorming moet u rekening houden met 3-5 minuten tussen afzonderlijke frames.OPMERKING: Afhankelijk van de microscoopopstelling moet de focus mogelijk met tussenpozen worden aangepast tijdens langere time-lapse-experimenten.