טומוגרפיה פוטואקוסטית, אולטרסאונד ואנגיוגרפיה משולבת (PAUSAT) להדמיית מוח שלם לא פולשנית של שבץ איסכמי
Summary
עבודה זו מדגימה את השימוש בפלטפורמת הדמיה מבוססת אולטרסאונד מולטימודאלי להדמיה לא פולשנית של שבץ איסכמי. מערכת זו מאפשרת לכמת חמצון דם באמצעות הדמיה פוטואקוסטית וזילוח לקוי במוח באמצעות אנגיוגרפיה אקוסטית.
Abstract
מוצג כאן מחקר שבץ איסכמי ניסיוני באמצעות מערכת הדמיה לא פולשנית שפיתחנו לאחרונה המשלבת שלוש טכנולוגיות הדמיה מבוססות אקוסטיקה: פוטואקוסטית, אולטרסאונד וטומוגרפיה אנגיוגרפית (PAUSAT). שילוב שלושת השיטות הללו מסייע ברכישת טומוגרפיה פוטואקוסטית מולטי-ספקטרלית (PAT) של חמצון הדם במוח, הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה של רקמת המוח ואנגיוגרפיה אקוסטית של זילוח הדם המוחי. פלטפורמת ההדמיה הרב-מודאלית מאפשרת לחקור את שינויי הזלוף והחמצון המוחיים במוח העכבר כולו לאחר שבץ. שני מודלים נפוצים של שבץ איסכמי הוערכו: מודל חסימת עורק המוח האמצעי הקבוע (pMCAO) והמודל הפוטוטרומבוטי (PT). PAUSAT שימש כדי לדמיין את אותם מוחות עכבר לפני ואחרי שבץ ולנתח כמותית את שני המודלים של שבץ. מערכת הדמיה זו הצליחה להראות בבירור את השינויים בכלי הדם במוח לאחר שבץ איסכמי, כולל הפחתה משמעותית בזילוח הדם וחמצון באזור אוטם השבץ (ipsilateral) בהשוואה לרקמה שלא נפגעה (contralateral). התוצאות אושרו הן על ידי הדמיית ניגודיות כתמי לייזר והן על ידי צביעת טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC). יתר על כן, נפח אוטם שבץ בשני המודלים שבץ נמדד ואומת על ידי צביעת TTC כאמת הקרקע. באמצעות מחקר זה, הוכחנו כי PAUSAT יכול להיות כלי רב עוצמה במחקרים פרה-קליניים לא פולשניים ואורכיים של שבץ איסכמי.
Introduction
הדם מוביל חמצן (דרך חלבון המוגלובין) וחומרים מזינים חשובים אחרים לרקמות בגופנו. כאשר זרימת הדם דרך רקמות מופרעת (איסכמיה), נזק חמור לרקמות יכול להתרחש, ההשפעות המיידיות ביותר של אשר נובעים מחוסר חמצן (היפוקסיה). שבץ איסכמי הוא תוצאה של זרימת דם מופרעת לאזור מסוים במוח. הנזק המוחי הנובע משבץ איסכמי יכול להתרחש בתוך דקות מחסימת כלי הדם, ולעתים קרובות יכול להיות בעל השפעות מתישות ומתמשכות 1,2. אסטרטגיה בעלת ערך רב להעריך את הפיזיופתולוגיה לאחר שבץ איסכמי ולזהות ולבדוק טיפולים חדשים היא השימוש במודלים של בעלי חיים קטנים במעבדה. הטיפולים המתגלים במעבדה שואפים להיות מתורגמים לשימוש קליני ולשפר את חיי המטופלים. עם זאת, השימוש בבעלי חיים במחקר ביו-רפואי צריך להיבחן בקפידה על פי עקרונות 3Rs של ראסל וברץ’: החלפה, הפחתה ועידון3. מטרת רכיב ההפחתה היא לצמצם את מספר בעלי החיים מבלי לפגוע באיסוף הנתונים. בהתחשב בכך, היכולת להעריך לאורך את התפתחות הנגע באמצעות הדמיה לא פולשנית מאפשרת יתרון גדול בהפחתת מספר בעלי החיים הנדרשים, כמו גם למקסם את המידע המתקבל מכל חיה4.
טומוגרפיה פוטואקוסטית (PAT) היא שיטת הדמיה היברידית המשלבת ניגודיות ספיגה אופטית עם דימות אולטרסאונד ברזולוציה מרחבית5. מנגנון ההדמיה של PAT הוא כדלקמן. פולס לייזר עירור מואר על המטרה המצולמת. בהנחה שהמטרה בולעת אור באורך הגל של לייזר העירור, הטמפרטורה שלו תעלה. עלייה מהירה זו בטמפרטורה גורמת להתרחבות תרמו-אלסטית של המטרה. ההתפשטות גורמת לגל אולטרסאונד להתפשט החוצה מהמטרה. על ידי גילוי גל האולטרסאונד במיקומים רבים, הזמן הדרוש לגל להתפשט מהמטרה לגלאים יכול לשמש ליצירת תמונה באמצעות אלגוריתם שחזור. היכולת של PAT לזהות ספיגה אופטית באזורי רקמות עמוקים מבדילה PAT מהדמיית אולטרסאונד, המזהה גבולות של עכבות אקוסטיות שונות של רקמות5. בספקטרום הנראה והתת-אדום הקרוב, הביומולקולות העיקריות בעלות ספיגה גבוהה הנמצאות בשפע באורגניזמים הן המוגלובין, שומנים, מלנין ומים7. עניין מיוחד בחקר שבץ מוחי הוא המוגלובין. מכיוון שלאוקסיהמוגלובין ולדאוקסיהמוגלובין יש ספקטרום ספיגה אופטי שונה, ניתן להשתמש ב- PAT עם אורכי גל לייזר עירור מרובים כדי לקבוע את הריכוז היחסי של שני מצבי החלבון. זה מאפשר את ריווי החמצן של המוגלובין (sO2), או חמצון הדם, להיות מכומת בתוך ומחוץ לאזור אוטם 8,9. זהו מדד חשוב בשבץ איסכמי, שכן הוא יכול להצביע על רמת החמצן ברקמת המוח הפגועה לאחר איסכמיה.
אנגיוגרפיה אקוסטית (AA) היא שיטת דימות אולטרסאונד משופרת בניגודיות השימושית במיוחד להדמיית המורפולוגיה של כלי הדם in vivo10. השיטה מסתמכת על שימוש במתמר מתנודד דו-אלמנטי (אלמנט בתדר נמוך ואלמנט בתדר גבוה) בשילוב עם מיקרו-בועות המוזרקות למערכת הדם של נושא ההדמיה. אלמנט התדר הנמוך של המתמר משמש לשידור בתדר התהודה של המיקרו-בועות (למשל, 2 מגה-הרץ), ואילו אלמנט התדר הגבוה משמש לקליטת האותות הסופר-הרמוניים של המיקרו-בועות (למשל, 26 מגה-הרץ). כאשר הן מעוררות בתדר תהודה, למיקרו-בועות יש תגובה לא ליניארית חזקה, וכתוצאה מכך נוצרות אותות סופר-הרמוניים שרקמות הגוף הסובבות אותן אינן מייצרות11. על ידי קבלה עם אלמנט בתדר גבוה, זה מבטיח כי רק אותות microbubble מזוהים. מכיוון שהמיקרו-בועות מוגבלות לכלי הדם, התוצאה היא תמונה אנגיוגרפית של מורפולוגיה של כלי הדם. AA היא שיטה רבת עוצמה להדמיית שבץ איסכמי, מכיוון שהמיקרו-בועות הזורמות דרך מערכת הדם אינן מסוגלות לזרום דרך כלי דם חסומים. זה מאפשר AA לזהות אזורים במוח שאינם מחוררים עקב שבץ איסכמי, אשר מציין את אזור האוטם.
מחקר שבץ איסכמי פרה-קליני מסתמך בדרך כלל על שימוש בהיסטולוגיה ובבדיקות התנהגותיות כדי להעריך את המיקום והחומרה של השבץ. צביעת Triphenyltetrazolium chloride (TTC) היא ניתוח היסטולוגי נפוץ המשמש לקביעת נפח אוטם שבץ. עם זאת, ניתן להשתמש בו רק בנקודת קצה, שכן הוא דורש המתת חסד של בעל החיים12 . ניתן להשתמש במבחנים התנהגותיים כדי לקבוע פגיעה בתפקוד המוטורי במספר נקודות זמן, אך הם אינם יכולים לספק ערכים אנטומיים או פיזיולוגיים כמותיים13. הדמיה ביו-רפואית מספקת גישה כמותית יותר לחקר ההשפעות של שבץ איסכמי באופן לא פולשני ואורכי 9,14,15. עם זאת, טכנולוגיות הדמיה קיימות (כגון דימות תהודה מגנטית של בעלי חיים קטנים [MRI]) יכולות לבוא בעלות גבוהה, לא להיות מסוגלות לספק מידע מבני ותפקודי בו-זמני, או שיש להן עומק חדירה מוגבל (כמו רוב טכניקות הדימות האופטי).
כאן אנו משלבים טומוגרפיה פוטואקוסטית, אולטרסאונד ואנגיוגרפיה (PAUSAT; ראו תרשים מערכת באיור 1), המאפשרת מידע מבני ותפקודי משלים של זילוח דם וחמצון לאחר שבץ איסכמי16. אלה שני היבטים חשובים בהערכת חומרת הפציעה ובמעקב אחר ההחלמה או התגובה לטיפולים. שימוש בשיטות הדמיה משולבות אלה יכול להגדיל את כמות המידע המתקבל על ידי כל בעל חיים, להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים ולספק מידע נוסף במחקר של טיפולים פוטנציאליים לשבץ איסכמי.
איור 1: דיאגרמת PAUSAT. (A) סכמה מלאה של מערכת PAUSAT, כולל הלייזר וה-OPO המשמשים ל-PAT. (B) מבט מבפנים על מערכת PAUSAT, כולל שני מתמרי אולטרסאונד. מתמר המתנדנד הדו-אלמנטי משמש הן לאולטרסאונד במצב B והן ל-AA, ומתמר המערך הליניארי משמש ל-PAT. שני המתמרים מותקנים על אותה במה ממונעת דו-ממדית, המאפשרת סריקה להפקת נתונים נפחיים. נתון זה שונהמ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם כמה היבטים חיוניים של שיטה זו, שאם נעשה בצורה לא נכונה, יכול להוביל לירידה משמעותית באיכות התמונה וניתוח כמותי. התוצאה הנפוצה ביותר של שגיאת משתמש בתמונות PAUSAT היא חוסר אות או עוצמת אות נמוכה מאוד, שתיהן יכולות להתרחש ממגוון סיבות. סיבה אחת כזו היא בעיה בצימוד האקוסטי. בועות אוויר גדולו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לצוות ההנדסה של SonoVol Inc. על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו מומנה חלקית על ידי פרס איגוד הלב האמריקאי למדעים שיתופיים (18CSA34080277), לג’יי יאו וו’ יאנג; המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית (NIH) מעניקים R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (יוזמת המוח), R01 NS111039, R01 EB028143; פרס CAREER של הקרן הלאומית למדע של ארצות הברית (NSF) 2144788; מענק יוזמת צוקרברג ע”ש צ’אן (2020-226178), לג’יי יאו; וה-NIH מעניק R21NS127163 ו-R01NS099590 ל-W. Yang.
Materials
| 20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
| 532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
| Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
| Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
| C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
| Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
| Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
| Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
| Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
| Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
| Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
| High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
| IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
| Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
| Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
| Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
| Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
| Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
| Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
| Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
| Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
| Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
| VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |
References
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 87 (1), 179-197 (2007).
- Vander Worp, H. B., van Gijn, J. Clinical Practice. Acute ischemic stroke. The New England Journal of Medicine. 357 (6), 572-579 (2007).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch’s 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Hochrainer, K., Yang, W. Stroke proteomics: from discovery to diagnostic and therapeutic applications. Circulation Research. 130 (8), 1145-1166 (2022).
- Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nature Methods. 13 (8), 627-638 (2016).
- Aldrich, J. E. Basic physics of ultrasound imaging. Critical Care Medicine. 35 (5), S131-S137 (2007).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37-R61 (2013).
- Li, M., Tang, Y., Yao, J. Photoacoustic tomography of blood oxygenation: a mini review. Photoacoustics. 10, 65-73 (2018).
- Menozzi, L., Yang, W., Feng, W., Yao, J. Sound out the impaired perfusion: Photoacoustic imaging in preclinical ischemic stroke. Frontiers in Neuroscience. 16, 1055552 (2022).
- Gessner, R. C., Frederick, C. B., Foster, F. S., Dayton, P. A. Acoustic angiography: a new imaging modality for assessing microvasculature architecture. International Journal of Biomedical Imaging. 2013, 936593 (2013).
- Dayton, P. A., Rychak, J. J. Molecular ultrasound imaging using microbubble contrast agents. Frontiers in Bioscience. 12, 5124-5142 (2007).
- Isayama, K., Pitts, L. H., Nishimura, M. C. Evaluation of 2, 3, 5-triphenyitetrazolium chloride staining to delineate rat brain infarcts. Stroke. 22 (11), 1394-1398 (1991).
- Ruan, J., Yao, Y. Behavioral tests in rodent models of stroke. Brain Hemorrhages. 1 (4), 171-184 (2020).
- Parthasarathy, A. B., Kazmi, S. M. S., Dunn, A. K. Quantitative imaging of ischemic stroke through thinned skull in mice with Multi Exposure Speckle Imaging. Biomedical Optics Express. 1 (1), 246-259 (2010).
- Hingot, V., et al. Early ultrafast ultrasound imaging of cerebral perfusion correlates with ischemic stroke outcomes and responses to treatment in mice. Theranostics. 10 (17), 7480-7491 (2020).
- Menozzi, L., et al. Three-dimensional non-invasive brain imaging of ischemic stroke by integrated photoacoustic, ultrasound and angiographic tomography (PAUSAT). Photoacoustics. 29, 100444 (2022).
- Llovera, G., Roth, S., Plesnila, N., Veltkamp, R., Liesz, A. Modeling stroke in mice: permanent coagulation of the distal middle cerebral artery. Journal of Visualized Experiments. (89), e51729 (2014).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Fern, R., Gibson, C. L. An alternative surgical approach reduces variability following filament induction of experimental stroke in mice. Disease Models & Mechanisms. 10 (7), 931-938 (2017).
- Labat-Gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. Journal of Visualized Experiments. (76), e50370 (2013).
- Matsumoto, Y., et al. Visualising peripheral arterioles and venules through high-resolution and large-area photoacoustic imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14930 (2018).
- Xu, Y., Wang, L. V., Ambartsoumian, G., Kuchment, P. Reconstructions in limited-view thermoacoustic tomography. Medical Physics. 31 (4), 724-733 (2004).
- Yal Tang, ., et al. High-fidelity deep functional photoacoustic tomography enhanced by virtual point sources. Photoacoustics. 29, 100450 (2023).
- Zheng, W., Huang, C., Zhang, H., Xia, J. Slit-based photoacoustic tomography with co-planar light illumination and acoustic detection for high-resolution vascular imaging in human using a linear transducer array. Biomedical Engineering Letters. 12 (2), 125-133 (2022).
- Wang, Y., et al. Slit-enabled linear-array photoacoustic tomography with near isotropic spatial resolution in three dimensions. Optics Letters. 41 (1), 127-130 (2016).
- Vu, T., Li, M., Humayun, H., Zhou, Y., Yao, J. A generative adversarial network for artifact removal in photoacoustic computed tomography with a linear-array transducer. Experimental Biology and Medicine. 245 (7), 597-605 (2020).
- Zhang, H., et al. Deep-E: A fully-dense neural network for improving the elevation resolution in linear-array-based photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (5), 1279-1288 (2022).
- Hauptmann, A., et al. Model-based learning for accelerated, limited-view 3-D photoacoustic tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 37 (6), 1382-1393 (2018).
- Li, M., et al. Three-dimensional deep-tissue functional and molecular imaging by integrated photoacoustic, ultrasound, and angiographic tomography (PAUSAT). IEEE Transactions on Medical Imaging. 41 (10), 2704-2714 (2022).
