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Abstract
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발생학

Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

Published: April 14, 2023
doi:
10.3791/65314
, ,
1Department of Biological Sciences,Dartmouth College, 2School of Life Sciences,Westlake University, 3Department of Molecular Biology,Princeton University

Summary

액토미오신 수축성은 세포 및 조직 형태 형성에 중요한 역할을 합니다. 그러나, 생체 내에서 악토미오신 수축성을 급격히 조작하는 것은 어렵다. 이 프로토콜은 초파리 배아에서 Rho1 매개 악토미오신 수축성을 빠르게 억제하는 광유전학적 시스템을 설명하여 생체 내에서 악토미오신이 비활성화된 후 상피 긴장의 즉각적인 손실을 나타냅니다.

Abstract

액틴 및 비근육 미오신 II에 의해 생성된 수축력(“악토미오신 수축성”)은 세포 분열, 세포 이동, 상피 접힘 및 분지 형태 형성과 같은 여러 길이 척도에서 세포 및 조직의 형태학적 변화에 중요합니다. 형태 형성에서 악토미오신 수축성의 역할에 대한 심층적인 이해는 기존의 유전적 또는 약리학적 접근 방식으로는 달성하기 어려운 악토미오신 수축의 신속한 비활성화를 허용하는 접근 방식을 필요로 합니다. 제시된 프로토콜은 정확한 시간 및 공간 제어로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 억제하기 위해 CRY2-CIBN 기반 광유전학적 이합체화 시스템인 Opto-Rho1DN의 사용을 보여줍니다. 이 시스템에서 CRY2는 Rho1(Rho1DN)의 우세한 음성 형태에 융합되는 반면 CIBN은 원형질막에 고정됩니다. CRY2 및 CIBN의 청색광 매개 이량체화는 세포질에서 원형질막으로 Rho1DN의 빠른 전좌를 초래하며, 여기서 내인성 Rho1을 억제하여 악토미오신 비활성화를 초래합니다. 또한, 이 기사는 초파리 복부 고랑 형성 동안 상피 긴장을 생성하는 악토미오신의 역할을 조사하기 위해 악토미오신의 Opto-Rho1DN 매개 비활성화와 레이저 절제를 결합하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 최소한의 수정으로 초파리 배아에서 악토미오신 수축성을 포함하는 다른 많은 형태학적 과정에 적용할 수 있습니다. 전반적으로, 이 광유전학적 도구는 동적 조직 리모델링 동안 조직 역학을 제어하는 악토미오신 수축성의 기능을 해부하는 강력한 접근 방식입니다.

Introduction

액토미오신 수축성(actomyosin contractility)은 F-액틴 네트워크에서 비근육 미오신 II(이하 ‘미오신’)에 의해 가해지는 수축력으로, 세포 형태를 변화시키고 조직 수준의 형태 형성을 유도하는 가장 중요한 힘 중 하나이다 1,2. 예를 들어, 상피 세포의 정점 도메인에서 악토미오신 수축성의 활성화는 정단 수축을 초래하며, 이는 상피 접힘, 세포 압출, 박리 및 상처 치유를 포함한 다양한 형태 형성 과정을 촉진합니다 3,4,5,6,7 . 미오신의 활성화는 그의 조절 경쇄의 인산화를 필요로 한다. 이 변형은 미오신 분자의 억제 형태를 완화하여 양쪽 끝에 여러 헤드 도메인이 있는 양극성 미오신 필라멘트 다발을 형성할 수 있도록 합니다. 양극성 미오신 필라멘트는 액틴 필라멘트의 역평행 운동을 유도하고 수축력 1,8,9를 생성합니다.

진화적으로 보존된 Rho 계열의 작은 GTPase RhoA(초파리의 Rho1)는 다양한 세포 맥락에서 악토미오신 수축성의 활성화에 중심적인 역할을 한다10,11. Rho1은 GTP(활성형) 또는 GDP(비활성형)12에 결합하여 이분자 스위치로 기능합니다. GTP 또는 GDP 결합 Rho1 사이의 순환은 GTPase 활성화 단백질(GAP)과 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF)에 의해 조절됩니다13. GEF는 GTP에 대한 GDP의 교환을 촉진하여 Rho1 활성을 활성화하는 기능을 합니다. 반면에 GAP는 Rho1의 GTPase 활성을 향상시켜 Rho1을 비활성화합니다. 활성화된 Rho1은 다운스트림 이펙터인 Rho 관련 키나아제(Rok) 및 Diaphanous14와 상호 작용하고 활성화하여 악토미오신 수축성을 촉진합니다. Rok은 미오신15의 조절 경쇄를 인산화하여 미오신 활성화 및 악토미오신 수축성을 유도한다. 또한, Rok은 또한 미오신 조절 경쇄 포스파타제를 억제하고, 따라서 미오신 필라멘트 조립을 더욱 촉진한다16. Rok은 또한 LIM 키나아제를 인산화할 수 있으며, 이는 활성화될 때 액틴-해중합 인자인 코필린(17,18)을 인산화 및 억제함으로써 액틴 분해를 방지합니다. Diaphanous는 액틴 중합을 촉진하는 포르민 계열 액틴 핵제로, 미오신이 19,20,21과 상호 작용할 수 있는 염기를 제공합니다.

악토미오신 수축성을 활성화하는 세포 메커니즘은 잘 밝혀졌지만 동적 조직 리모델링을 조절하는 기능에 대한 우리의 이해는 불완전합니다. 이러한 지식 격차를 메우기 위해서는 생체 내 특정 조직 영역에서 악토미오신 (actomyosin)을 빠르게 비활성화하고 조직 거동 및 특성에 대한 즉각적인 영향을 기록할 수 있는 접근법이 필요합니다. 이 프로토콜은 초파리 중배엽 침윤 동안 악토미오신 수축성을 급격히 억제하기 위한 광유전학적 접근법의 사용을 설명하고 레이저 절제를 사용하여 상피 장력을 측정하는 것을 설명합니다. 초파리 위스트레이션(Drosophila gastrulation) 동안, 복부에 국한된 중배엽 전구체 세포는 정점 수축을 겪고 전후방 배향 고랑을 형성하여 배아 표면에서 침윤합니다22,23. 복부 고랑의 형성은 오랫동안 상피 접힘의 메커니즘을 연구하기위한 모델로 사용되어 왔습니다. 복부 고랑 형성은 Drosophila24,25,26,27의 등-복부 패턴 시스템에 의해 관리됩니다. 배아의 복부 쪽에 위치한 두 가지 전사 인자인 트위스트(Twist)와 달팽이(Snail)의 발현은 복부 고랑 형성을 조절하고 중배엽 세포의 운명을 지정한다28. Twist and Snail은 G-단백질 결합 수용체 경로와 RhoGEF2 어댑터 단백질인 T48 29,30,31,32,33을 통해 중배엽 전구체 세포의 정점으로 Rho1 GEF RhoGEF2의 모집을 활성화합니다. 다음으로, RhoGEF2는 Rho-Rho 키나아제 경로 34,35,36,37,38,39를 통해 잠재적 중배엽의 정점 표면 전체에 걸쳐 미오신을 활성화합니다. 활성화된 미오신은 중배엽 원시의 정점 표면 전체에 걸쳐 세포상 악토미오신 네트워크를 형성하며, 그 수축은 정점 수축을 유도하고 정점 조직 장력의 급격한 증가를 초래한다 14,37,40.

이 프로토콜에 설명된 광유전학적 도구인 Opto-Rho1DN은 Rho1(Rho1DN)41의 지배적인 음성 형태의 청색광 의존성 원형질막 모집을 통해 악토미오신 수축성을 억제합니다. Rho1DN의 T19N 돌연변이는 GDP를 GTP로 교환하는 돌연변이 단백질의 능력을 제거하여 단백질을 영구적으로 비활성화합니다34. Rho1DN, C189Y의 후속 돌연변이는 신호42,43을 표적으로 하는 순진한 막을 제거합니다. Rho1DN이 원형질막에 주입되면 Rho1 GEF에 결합하여 가두어 Rho1의 활성화와 미오신 및 액틴의 Rho1 매개 활성화를 차단합니다34,44. Rho1DN의 원형질막 모집은 Cryptochrome 2 및 결합 파트너 CIB1에서 파생된 광 의존성 이량체화 모듈을 통해 달성됩니다. 크립토크롬 2는 애기장대45에 있는 청색광 활성화 크립토크롬 광수용체입니다. 크립토크롬 2는 광여기 상태에서만 기본 나선-루프-나선 단백질인 CIB1에 결합합니다45. 크립토크롬 2(Cryptochrome 2, CRY2 PHR, 이하 CRY2로 지칭)와 CIB1(이하 CIBN)의 N-말단 도메인(aa 1-170)으로부터 보존된 N-말단, 광분해효소 상동성 영역(PHR)이 광-유도 이량체화에 중요하다는 것이 나중에 밝혀졌다46. Opto-Rho1DN에는 두 가지 구성 요소가 포함되어 있습니다. 제1 성분은 CAAX 앵커와 융합된 CIBN 단백질이며, 이는 단백질을 원형질막(47)에 국한시킨다. 두 번째 구성 요소는 Rho1DN41과 융합된 mCherry 태그가 부착된 CRY2입니다. 청색광이 없으면 CRY2-Rho1DN이 세포질에 남아 있습니다. 청색광 자극 시 CRY2-Rho1DN은 막 고정 CIBN과 여기 CRY2 사이의 상호 작용을 통해 원형질막을 표적으로 합니다. Opto-Rho1DN은 자외선 A (UVA) 광 및 청색광 (400-500 nm, 450-488 nm에서 피크 활성화) 또는 2 광자 자극41,46,47,48을 수행 할 때 830-980 nm 펄스 레이저에 의해 활성화 될 수 있습니다. 따라서 Opto-Rho1DN은 여기 GFP에 일반적으로 사용되는 파장(단일 광자 이미징의 경우 488nm, 이광자 이미징의 경우 920nm)에 의해 자극됩니다. 대조적으로, 여기 mCherry에 일반적으로 사용되는 파장(단일 광자 이미징의 경우 561nm, 이광자 이미징의 경우 1,040nm)은 광유전학적 모듈을 자극하지 않으므로 사전 자극 이미징에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 샘플 조작 중 원치 않는 자극의 위험을 최소화하는 데 사용되는 접근 방식을 설명합니다.

레이저 절제는 세포와 조직의 장력을 감지하고 측정하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다49. 이전 연구에서는 레이저 강도가 적절하게 제어될 때 펨토초 근적외선 레이저를 사용하는 이광자 레이저 절제가 원형질막 파거를 일으키지 않고 일부 세포 내 구조(예: 피질 악토미오신 네트워크)를 물리적으로 손상시킬 수 있음을 보여주었습니다(50,51). 조직이 장력을 받고 있는 경우 조직 내 관심 영역의 레이저 절제는 절제된 영역에 인접한 세포의 즉각적인 바깥쪽 반동을 초래합니다. 반동 속도는 장력의 크기 및 반동을 겪는 구조물을 둘러싼 매체(세포질)의 점도의 함수이다(49). 근적외선 레이저의 우수한 침투 깊이와 잘 제한된 초점 절제를 달성할 수 있는 능력으로 인해 이광자 레이저 절제는 생체 내에서 조직 장력을 감지하는 데 특히 유용합니다. 이 프로토콜에서 입증된 바와 같이, 이 방법은 동적 조직 리모델링 동안 조직 역학에 대한 Rho1 의존성 세포 수축성의 직접적인 영향을 조사하기 위해 악토미오신 수축성의 Opto-Rho1DN 매개 비활성화와 쉽게 결합될 수 있습니다.

Protocol

1. 유전자 십자가 설정 및 난자 채취 컵 준비 광유전학적 계통 UASp-CIBNpm(I)에서 암컷 파리(처녀)를 선택합니다. UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry(III)를 입체현미경 하의CO2 패드 상에서 모체 GAL4 드라이버 라인 67 Sqh-mCherry로부터 수컷 파리와 교배시키고; 15 E-카데린-GFP.참고: 67과 15는 각각 두 번째(II) 및 세 번째(III) 염색체에 삽입된 모체-Tubulin-GAL4를 나타냅니다(52). ?…

Representative Results

정점 수축을 겪고 있는 자극되지 않은 배아에서 Sqh-mCherry는 복부 중배엽 세포의 정근단 영역에서 농축된 반면 CRY2-Rho1DN-mCherry는 세포질이었습니다(그림 1A). 수축 영역 내의 레이저 절제는 AP 축을 따라 빠른 조직 반동을 일으켰습니다(그림 1B, C). 자극된 배아에서 CRY2-Rho1DN-mCherry 신호는 원형질막에 국한된 반면, Sqh-mCherry의 정점 신호는 완전?…

Discussion

이 프로토콜은 악토미오신 수축성이 비활성화된 직후 조직 장력의 변화를 조사하기 위해 광유전학과 레이저 절제의 병용을 설명했습니다. 여기에 설명된 광유전학적 도구는 Rho1(Rho1DN)의 지배적인 음성 형태를 이용하여 내인성 Rho1 및 Rho1 의존성 악토미오신 수축성을 급격히 억제합니다. 초파리 복부 고랑 형성의 맥락에서 Opto-Rho1DN의 이전 특성화는 이 도구가 동시 미오신 불활성화 및 액틴 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 이미징 지원에 대해 Ann Lavanway에게 감사를 표합니다. 저자들은 시약을 공유해 준 Wieschaus 연구실과 De Renzis 연구실에, 플라이 스톡에 대해 Bloomington Drosophila Stock Center에 감사를 표합니다. 이 연구는 NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 및 미국 암 학회 기관 연구 보조금 #IRG-82-003-33에 의해 BH에 지원됩니다.

Materials

35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation
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References

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OptogeneticsActomyosin ContractilityEpithelial TensionDrosophila EmbryosLaser AblationMechanical ForcesCell MechanicsCell Sheet FoldingApical Constriction

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Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).
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