Denne protokol beskriver en RNA-interferens og ChIP-assay for at studere den epigenetiske arv af RNAi-induceret hæmning og associerede kromatinmodifikationer i C. elegans.
Transgenerationel epigenetisk arv (TEI) tillader transmission af information gennem kimlinjen uden at ændre genomsekvensen gennem faktorer som ikke-kodende RNA’er og kromatinmodifikationer. Fænomenet RNA-interferens (RNAi) arv i nematoden Caenorhabditis elegans er en effektiv model til at undersøge TEI, der udnytter denne modelorganismes korte livscyklus, selvformering og gennemsigtighed. I RNAi-arv fører eksponering af dyr for RNAi til genhæmning og ændrede kromatinsignaturer på målstedet, der vedvarer i flere generationer i fravær af den oprindelige udløser. Denne protokol beskriver analysen af RNAi-arv i C. elegans ved hjælp af en kimlinje-udtrykt nukleært grønt fluorescerende protein (GFP) reporter. Reporterhæmning initieres ved at fodre dyrene med bakterier, der udtrykker dobbeltstrenget RNA rettet mod GFP. Ved hver generation passeres dyr for at opretholde synkroniseret udvikling, og reportergenhæmning bestemmes ved mikroskopi. Ved udvalgte generationer indsamles og behandles populationer til kromatinimmunudfældning (ChIP)-kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) for at måle histonmodifikationsberigelse på GFP-reporterens locus. Denne protokol til undersøgelse af RNAi-arv kan let ændres og kombineres med andre analyser for yderligere at undersøge TEI-faktorer i små RNA- og kromatinveje.
Epigenetisk arv tillader overførsel af genregulerende information på tværs af generationer og kan derfor tillade forældrenes miljø eller oplevelser at påvirke deres afkom. I C. elegans kan kimlinjegenhæmning initieret af eksogent dobbeltstrenget RNA (dsRNA) nedarves i flere generationer i afkom, der ikke udsættes for den oprindelige udløser 1,2,3,4. Denne proces, kaldet RNA-interferens (RNAi) arv, er et af flere relaterede epigenetiske hæmningsfænomener i C. elegans, herunder piRNA-initieret multigenerationel hæmning 2,5, paramutation / RNAe (RNA-induceret epigenetisk hæmning) 6,7,8 og multicopy array-initieret hæmning9, som har overlappende, men forskellige krav til små RNA- og kromatinreguleringsmaskiner . I C. elegans eksogene RNAi behandles dsRNA til små interfererende RNA’er (siRNA’er), der virker i et kompleks med primære Argonaut-proteiner for at genkende deres mål-mRNA. Denne målretning fører til amplifikation af sekundære siRNA’er, der associerer med sekundære argonauter for at dæmpe mål-mRNA gennem både cytoplasmatiske og nukleare hæmningsveje. For kimlinjeudtrykte RNAi-mål er de nukleare sekundære Argonaute HRDE-1 og yderligere nukleare RNAi-faktorer rettet mod spirende transkripter, hvilket resulterer i transkriptionel undertrykkelse og rekruttering af histonmethyltransferaser til deponering af repressive kromatinmærker, herunder H3K9me310. Histon H3K9me3 fremmer etableringen af arvelig hæmning af kimlinje-udtrykte grønne fluorescerende protein (GFP) transgener ved RNAi arv11,12.
Målet med denne protokol er at anvende et transgen, der udtrykker et GFP-histonfusionsprotein i kimlinjen som reporter for RNAi-arv og at analysere ændringer i histonmodifikationer på reportertransgen-locus ved anvendelse af kromatinimmunudfældning og kvantitativ polymerasekædereaktion (ChIP-qPCR). Denne protokol beskriver en standardiseret pladebaseret RNAi-fodringsmetode til initiering af reporterhæmning. Det giver også en detaljeret tidslinje for overførsel af dyr mellem generationer ved isolering i livmoderembryoner fra gravide voksne ved alkalisk hypochloritbehandling (“blegning”). Metoder og repræsentative data til overvågning af hyppigheden af GFP-hæmning i en delmængde af populationen ved fluorescensmikroskopi og for histon H3K9me3 ChIP-qPCR er også beskrevet. Reporterbaserede RNAi-arveassays giver et meget medgørligt system til funktionelt at dissekere rollerne af genetiske og miljømæssige faktorer i epigenetisk regulering 13,14, og genetiske skærme ved hjælp af sådanne reportere har identificeret både gener, der kræves til 2,3,15 og gener, der negativt regulerer16,17 varigheden af transgenerationel epigenetisk arv.
I denne protokol introduceres dsRNA ved fodring, som er blevet en standardmetode i C. elegans18. For RNAi-arveassays giver fodringsmetoden en nem metode til at opnå en stor P0-population 2,11,12,22,23,24,25. Imidlertid påvirker timingen og varigheden af RNAi-eksponering effektiviteten af transgenhæmning26, og koncentrationen af RNAi-bakterier påvirker persistensen af arvelig RNAi-hæmning1. Derfor er standardiserede RNAi-bakterier og ormevækst vigtige for at opnå et ensartet niveau af GFP-hæmning og arvevarighed. Her belægges embryoner på RNAi-plader, så P0-dyr udsættes for RNAi-bakterier fra klækning. Alternative tilgange har belagt synkroniserede L1 24,27 ellerL4 25 fase dyr på RNAi-NGM plader. Da sult og andre belastninger påvirker vedligeholdelsen af RNAi-arv13, skal pladerne overvåges for at forhindre overfyldning og udmattelse af fødevareforsyningen. Som et alternativ til at initiere RNAi ved fodring inducerede nogle af pionererne C. elegans RNAi-arvestudier RNAi gennem gonadeinjektion, hvilket giver en større kontrol af dsRNA-koncentrationen 1,28.
I denne protokol passeres hver generation som en population med alkalisk hypochloritbehandling, som tidligere beskrevet 16,22,23,24. Hypochloritbehandling sikrer, at F1-generationen ikke bliver forurenet med RNAi-bakterier fra forældremiljøet22 og forhindrer potentiel uønsket befolkningsflaskehals. Imidlertid kan bulkoverførsel også være en begrænsning, da individuelle dyr kan have forskellige arvemønstre 1,29. En alternativ metode til at fastslå hver generation er at udvælge individuelle dyr 1,2,9,11,25. Denne tilgang giver mulighed for at spore fænotyper inden for slægter og inkorporering af genetiske krydsninger. Afstamningsanalyse kan også være fordelagtigt for fænotyper med lav penetrans12.
Fluorescerende proteinekspression er en kraftfuld og bekvem aflæsning af RNAi-induceret hæmning 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Som beskrevet i denne protokol kan GFP-udtryk manuelt scores som ON eller OFF 11,12,15,16,25. Manuel scoring kan forbedres yderligere ved at tildele kvalitative intensitetsniveauer 3,4,14. Alternativt kan automatiseret intensitetsscoring af mikroskopibilleder 11,12,14,25,27 eller flowcytometrifluorescensmåling af levende dyr2 give en kvantitativ aflæsning med høj kapacitet. Da reporterekspressionen imidlertid er begrænset til kimlinjen, er en advarsel ved automatiserede tilgange, at de også skal skelne mellem dyr med tavs GFP-ekspression versus dyr uden kimlinje, især hvis undersøgelsen inkorporerer mutanter med unormal kimlinjeudvikling. Som et alternativ til GFP-fluorescens kan revers transkription (RT)-qPCR anvendes til at kvantificere RNAi-målpræ-mRNA- og mRNA-niveauer 2,16,23,24. Denne tilgang giver en mere direkte aflæsning af hæmning, som er rettet mod RNA, og er især nyttig for andre RNAi-mål, hvor hæmning ikke producerer en synlig fænotype. En begrænsning ved at bruge kunstige GFP-reportere er, at eksogene og endogene sekvenser reguleres forskelligt i transgenerationelt RNAi11. Undersøgelser med endogene mål, såsom den temperaturfølsomme embryonale letalallel oma-1(zu405)1,11,16,25, bør derfor betragtes som en komplementær tilgang til fluorescerende transgenreportere.
Analysen af ChIP i forbindelse med RNAi-arveassays kræver sammenligning mellem behandlinger og replikater. For det første, for at tage højde for forskelle i udgangsmateriale mellem prøver, normaliseres ChIP-signalet til indgangssignal på samme sted som ‘procentdelen af input’. Behandling af en histon H3 ChIP parallelt vil bidrage til at bestemme, om eventuelle histonmodifikationsændringer svarer til ændringer i nukleosomtæthed. Da ChIP desuden er en proces i flere trin, kan effektiviteten variere mellem prøverne. Udvælgelsen af egnede positive og negative kontrolsteder er nyttig til evaluering og sammenligning af signal-støjforholdet mellem prøver og forsøg. For at lette sammenligninger mellem prøver normaliseres ChIP DNA qPCR-tærskelcyklusværdierne ved RNAi-målet ofte til et kontrolsted 3,11,15,23,30,31. For at evaluere virkningerne af RNAi-behandlingen sammenlignes også forholdet mellem ChIP-signalet i behandlings-RNAi versus kontrol eller ingen RNAi-betingelser. En begrænsning af den nuværende tilgang er, at ChIP udføres med hele dyr, mens responset på RNAi-behandling kan være unikt for kimlinjen. En tilgang til at overvinde denne advarsel er at udføre ChIP ved hjælp af isolerede kimlinjekerner. Yderligere tekniske overvejelser for optimering af ChIP er også blevet diskuteret udførligt andetsteds32,33.
Samlet set giver denne RNAi-arv og ChIP-protokol et detaljeret og let at tilpasse fundament, der kan integreres med andre teknikker til yderligere at udforske transgenerationel epigenetisk regulering. For eksempel kan sekventeringsbiblioteker med høj kapacitet konstrueres ud fra ChIP-DNA (ChIP-seq) for en mere detaljeret visning af kromatinlandskabet både proksimalt til RNAi-målet og på genom-bred skala.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker at anerkende laboratorierne i C. elegans-samfundet , der udviklede og delte værktøjerne, og hvis arbejde er citeret i dette manuskript. Nogle stammer blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af et Canadian Institutes of Health Research (CIHR) projekttilskud til A.L.S. (PJT-175245). CL støttes af et Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) postgraduate stipendium (PGS-D).
Agarose | Bioshop | AGA002 | |
Ampicillin | Bioshop | AMP201 | Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab8898 | Concentration is batch-dependent (0.9 – 1 mg/mL). |
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab1791 | Concentration is batch-dependent (0.7 – 1 mg/mL). |
Bleach (6% Sodium hypochlorite) | Lavo | 02358107 | |
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter | NA | SX1263 | Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge. |
Carbenicillin | BioShop | CAR544 | Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Dynabeads Protein G Magnetic Beads | Invitrogen | 10003D | |
E. coli strain HT115(DE3) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | HT115(DE3) | |
E. coli strain OP50-1 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-1 | |
EDTA (0.5 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15575020 | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Formaldehyde (37%) | Sigma | F8775 | |
Glycine | Sigma | 50046 | Make a 1.25 M solution and store at 4 °C. |
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) | Teknova | H1035 | |
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells | VWR | 100488-904 | |
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) | BioShop | NON999 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) | BioShop | IPT001 | Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | |
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin | NA | NA | Standard lab recipe. |
Levamisole (Tetramisole hydrochloride) | Sigma | L9756 | Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C. |
LiCl (8 M) | Sigma | L7026 | |
M9 Buffer | NA | NA | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4. |
Magnetic Separator (1.5 mL tubes) | Applied Biosystems | A13346 | |
Magnetic Separator (0.2 mL tubes) | Permagen | MSR812 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12541B | |
Microscope Slide | Technologist Choice | LAB-037 | |
NaCl (5 M) | Promega | V4221 | For ChIP buffers. |
NaOH | Sigma | S5881 | Make a 10 M solution and store at room temperature. |
NGM Plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin. |
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) | Cell Signaling Technology | 2729 | |
Petri Dishes (35 mm x 10 mm) | Sarstedt | 82.1135.500 | |
Phosphate Buffered Saline (10X) | Fisher BioReagents | BP3991 | |
Plasmid – Control RNAi | Addgene | L4440 (Plasmid #1654) | |
Plasmid – GFP-targetting RNAi | Addgene | L4417 (Plasmid #1649) | Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used. |
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG |
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT |
Primer pair [clec-18] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA |
Primer pair [gfp exon 1] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC |
Primer pair [gfp exon 4] | Integrated DNA Technologies | NA | F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA |
Primer pair [hrp-2] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA |
Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 11836170001 | |
Proteinase K | Bioline | BIO-37084 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 | |
RNAi-NGM plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG. |
RNase A | Sigma | R4642 | |
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma | L5777 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
SDS | Sigma | 74255 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature. |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
Sonication Tube | Evergreen | 214-3721-010 | |
Sonication Tube Cap | Evergreen | 300-2911-020 | |
Sonicator | Qsonica | Q800R3-110 | |
Streptomycin sulfate | Bioshop | STP101 | Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
TAE buffer (1X) | NA | NA | 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA |
Tally counter clicker | Uline | H-7350 | |
Tetracycline | Bioshop | TET701 | Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C. |
Thermomixer | Eppendorf | 05-400-205 | |
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |