Denne protokollen beskriver en RNA-interferens og ChIP-analyse for å studere epigenetisk arv av RNAi-indusert silencing og tilhørende kromatinmodifikasjoner i C. elegans.
Transgenerasjonell epigenetisk arv (TEI) tillater overføring av informasjon gjennom kimlinjen uten å endre genomsekvensen, gjennom faktorer som ikke-kodende RNA og kromatinmodifikasjoner. Fenomenet RNA-interferens (RNAi) arv i nematoden Caenorhabditis elegans er en effektiv modell for å undersøke TEI som utnytter denne modellorganismens korte livssyklus, selvutbredelse og gjennomsiktighet. I RNAi-arv fører eksponering av dyr for RNAi til genaktivering og endrede kromatinsignaturer ved målstedet som vedvarer i flere generasjoner i fravær av den første utløseren. Denne protokollen beskriver analysen av RNAi-arv i C. elegans ved hjelp av en germline-uttrykt kjernefysisk grønt fluorescerende protein (GFP) reporter. Reporter-silencing initieres ved å mate dyrene med bakterier som uttrykker dobbeltstrenget RNA rettet mot GFP. Ved hver generasjon passeres dyr for å opprettholde synkronisert utvikling, og reportergenaktivering bestemmes ved mikroskopi. Ved utvalgte generasjoner samles populasjoner og behandles for kromatinimmunoprecipitasjon (ChIP)-kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR) for å måle histonmodifikasjonsanrikning ved GFP-reporterlokuset. Denne protokollen for å studere RNAi-arv kan enkelt modifiseres og kombineres med andre analyser for å undersøke TEI-faktorer i små RNA- og kromatinveier.
Epigenetisk arv tillater overføring av genreguleringsinformasjon over generasjoner og kan derfor tillate foreldrenes miljø eller erfaringer å påvirke deres avkom. I C. elegans kan germline-genaktivering initiert av eksogent dobbeltstrenget RNA (dsRNA) arves i flere generasjoner i avkom som ikke er utsatt for den opprinnelige utløseren 1,2,3,4. Denne prosessen, kalt RNA-interferens (RNAi) arv, er et av flere relaterte epigenetiske silencing fenomener i C. elegans, inkludert piRNA-initiert multigenerasjonell silencing 2,5, paramutasjon / RNAe (RNA-indusert epigenetisk silencing) 6,7,8 og multicopy array-initiert silencing9, som har overlappende, men forskjellige krav til små RNA- og kromatinreguleringsmaskiner . I C. elegans eksogene RNAi blir dsRNA behandlet i små forstyrrende RNA (siRNAer) som virker i et kompleks med primære Argonaute-proteiner for å gjenkjenne deres mål-mRNA. Denne målrettingen fører til forsterkning av sekundære siRNA som assosierer med sekundære argonauter for å dempe mål-mRNA gjennom både cytoplasmatiske og nukleære silencingveier. For germline-uttrykte RNAi-mål retter de kjernefysiske sekundære Argonaute HRDE-1 og ytterligere nukleære RNAi-faktorer seg mot begynnende transkripsjoner, noe som resulterer i transkripsjonell undertrykkelse og rekruttering av histonmetyltransferaser for å deponere repressive kromatinmerker, inkludert H3K9me310. Histon H3K9me3 fremmer etableringen av arvelig silencing av germline-uttrykt grønt fluorescerende protein (GFP) transgener ved RNAi-arv11,12.
Målet med denne protokollen er å bruke et transgen som uttrykker et GFP-histonfusjonsprotein i kimlinjen som reporter for RNAi-arv og å analysere endringer i histonmodifikasjoner ved reportertransgen-lokuset ved bruk av kromatinimmunopresipitasjon og kvantitativ polymerasekjedereaksjon (ChIP-qPCR). Denne protokollen beskriver en standardisert platebasert RNAi-fôringsmetode for å starte deaktivering av reporteren. Det gir også en detaljert tidslinje for passering av dyr mellom generasjoner ved å isolere embryoer in utero fra gravide voksne ved alkalisk hypoklorittbehandling (“bleking”). Metoder og representative data for overvåking av frekvensen av GFP-inaktivering i en undergruppe av populasjonen ved fluorescensmikroskopi og for histon H3K9me3 ChIP-qPCR er også beskrevet. Reporterbaserte RNAi-arveanalyser gir et svært håndterbart system for funksjonelt å dissekere rollene til genetiske og miljømessige faktorer i epigenetisk regulering 13,14, og genetiske skjermer ved hjelp av slike reportere har identifisert både gener som kreves for 2,3,15 og gener som negativt regulerer16,17 varigheten av transgenerasjonell epigenetisk arv.
I denne protokollen introduseres dsRNA ved fôring, som har blitt en standardmetode i C. elegans18. For RNAi-arveanalyser gir fôringsmetoden en enkel metode for å oppnå en stor P0-populasjon 2,11,12,22,23,24,25. Imidlertid påvirker tidspunktet og varigheten av RNAi-eksponering effekten av transgene silencing26, og konsentrasjonen av RNAi-bakterier påvirker persistensen av arvelig RNAi-inaktivering1. Derfor er standardiserte RNAi-bakterier og ormvekst viktig for å oppnå et konsistent nivå av GFP-silencing og varighet av arv. Her blir embryoer belagt på RNAi-plater slik at P0-dyr blir utsatt for RNAi-bakterier fra klekking. Alternative tilnærminger har belagt synkroniserte L1 24,27 ellerL4 25 scenedyr på RNAi-NGM-plater. I tillegg, siden sult og andre påkjenninger påvirker opprettholdelsen av RNAi-arv13, må tallerkener overvåkes for å forhindre overbefolkning og utmattelse av matforsyningen. Som et alternativ til å initiere RNAi ved fôring, induserte noen av pioneren C. elegans RNAi arvestudier RNAi gjennom gonadeinjeksjon, noe som gir større kontroll over dsRNA-konsentrasjon 1,28.
I denne protokollen passeres hver generasjon som en populasjon med alkalisk hypoklorittbehandling, som tidligere beskrevet 16,22,23,24. Hypoklorittbehandling sikrer at F1-generasjonen ikke vil bli forurenset med RNAi-bakterier fra foreldremiljøet22 og forhindrer potensiell uønsket populasjon flaskehalser. Bulkpassering kan imidlertid også være en begrensning, siden enkeltdyr kan ha distinkte arvemønstre 1,29. En alternativ metode for å etablere hver generasjon er å velge ut enkeltdyr 1,2,9,11,25. Denne tilnærmingen gjør det mulig å spore fenotyper i linjer og inkorporering av genetiske kryss. Avstamningsanalyse kan også være fordelaktig for fenotyper med lav penetrans12.
Fluorescerende proteinuttrykk er en kraftig og praktisk avlesning av RNAi-indusert silencing 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Som beskrevet i denne protokollen kan GFP-uttrykk manuelt skåres som PÅ eller AV 11,12,15,16,25. Manuell scoring kan forbedres ytterligere ved å tildele kvalitative intensitetsnivåer 3,4,14. Alternativt kan automatisert intensitetsskåring av mikroskopibilder 11,12,14,25,27 eller flowcytometrifluorescensmåling av levende dyr2 gi en kvantitativ og høy gjennomstrømningsavlesning. Men siden reporterens uttrykk er begrenset til kimlinjen, er et forbehold om automatiserte tilnærminger at de også må skille mellom dyr med lydløst GFP-uttrykk versus dyr uten kimlinje, spesielt hvis studien inkorporerer mutanter med unormal kimlinjeutvikling. Som et alternativ til GFP-fluorescens kan revers transkripsjon (RT)-qPCR brukes til å kvantifisere RNAi-målnivåer før mRNA og mRNA-nivåer 2,16,23,24. Denne tilnærmingen gir en mer direkte avlesning av lyddemping, som retter seg mot RNA, og er spesielt nyttig for andre RNAi-mål der deaktivering ikke produserer en synlig fenotype. En begrensning ved bruk av kunstige GFP-reportere er at eksogene og endogene sekvenser er differensielt regulert i transgenerasjonell RNAi11. Studier med endogene mål, som det temperaturfølsomme embryonale dødelige allelet oma-1(zu405)1,11,16,25, bør derfor betraktes som en komplementær tilnærming til fluorescerende transgenreportere.
Analysen av ChIP i sammenheng med RNAi-arveanalyser krever sammenligning mellom behandlinger og replikater. For det første, for å ta hensyn til forskjeller i startmateriale mellom prøver, normaliseres ChIP-signalet til inngangssignal på samme sted som ‘prosentandelen av inngang’. Behandling av en histon H3 ChIP parallelt vil bidra til å avgjøre om noen histonmodifikasjonsendringer samsvarer med endringer i nukleosomtetthet. I tillegg, fordi ChIP er en flertrinnsprosess, kan effektiviteten variere mellom prøver. Valget av passende positive og negative kontrollsteder er nyttig for å evaluere og sammenligne signal-støy-forholdet mellom prøver og eksperimenter. I tillegg, for å lette sammenligninger mellom prøver, blir ChIP DNA qPCR-terskelsyklusverdiene ved RNAi-målet ofte normalisert til et kontrollsted 3,11,15,23,30,31. For å evaluere effekten av RNAi-behandlingen, sammenlignes også forholdet mellom ChIP-signalet i behandling RNAi versus kontroll eller ingen RNAi-forhold. En begrensning av dagens tilnærming er at ChIP utføres med hele dyr, mens responsen på RNAi-behandling kan være unik for kimlinjen. En tilnærming for å overvinne dette forbeholdet er å utføre ChIP ved hjelp av isolerte kimlinjekjerner. Ytterligere tekniske hensyn for å optimalisere ChIP har også blitt diskutert mye andre steder32,33.
Samlet sett gir denne RNAi-arven og ChIP-protokollen et detaljert og lett å tilpasse fundament som kan integreres med andre teknikker for å utforske transgenerasjonell epigenetisk regulering ytterligere. For eksempel kan biblioteker med høy gjennomstrømningssekvensering konstrueres fra ChIP-DNA (ChIP-seq) for en mer detaljert visning av kromatinlandskapet både proksimalt for RNAi-målet og på genom-bred skala.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å anerkjenne laboratoriene i C. elegans-samfunnet som utviklet og delte verktøyene og hvis arbeid er sitert i dette manuskriptet. Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dette arbeidet ble støttet av et kanadisk institutt for helseforskning (CIHR) prosjektstipend til ALS (PJT-175245). CL støttes av et Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) forskerstipend (PGS-D).
Agarose | Bioshop | AGA002 | |
Ampicillin | Bioshop | AMP201 | Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab8898 | Concentration is batch-dependent (0.9 – 1 mg/mL). |
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody | Abcam | ab1791 | Concentration is batch-dependent (0.7 – 1 mg/mL). |
Bleach (6% Sodium hypochlorite) | Lavo | 02358107 | |
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter | NA | SX1263 | Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge. |
Carbenicillin | BioShop | CAR544 | Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
Dynabeads Protein G Magnetic Beads | Invitrogen | 10003D | |
E. coli strain HT115(DE3) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | HT115(DE3) | |
E. coli strain OP50-1 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-1 | |
EDTA (0.5 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15575020 | |
Fluorescence Stereoscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
Formaldehyde (37%) | Sigma | F8775 | |
Glycine | Sigma | 50046 | Make a 1.25 M solution and store at 4 °C. |
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5) | Teknova | H1035 | |
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells | VWR | 100488-904 | |
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate) | BioShop | NON999 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) | BioShop | IPT001 | Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725122 | |
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin | NA | NA | Standard lab recipe. |
Levamisole (Tetramisole hydrochloride) | Sigma | L9756 | Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C. |
LiCl (8 M) | Sigma | L7026 | |
M9 Buffer | NA | NA | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4. |
Magnetic Separator (1.5 mL tubes) | Applied Biosystems | A13346 | |
Magnetic Separator (0.2 mL tubes) | Permagen | MSR812 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12541B | |
Microscope Slide | Technologist Choice | LAB-037 | |
NaCl (5 M) | Promega | V4221 | For ChIP buffers. |
NaOH | Sigma | S5881 | Make a 10 M solution and store at room temperature. |
NGM Plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin. |
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL) | Cell Signaling Technology | 2729 | |
Petri Dishes (35 mm x 10 mm) | Sarstedt | 82.1135.500 | |
Phosphate Buffered Saline (10X) | Fisher BioReagents | BP3991 | |
Plasmid – Control RNAi | Addgene | L4440 (Plasmid #1654) | |
Plasmid – GFP-targetting RNAi | Addgene | L4417 (Plasmid #1649) | Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used. |
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG |
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT |
Primer pair [clec-18] | Integrated DNA Technologies | NA | F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA |
Primer pair [gfp exon 1] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC |
Primer pair [gfp exon 4] | Integrated DNA Technologies | NA | F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA |
Primer pair [hrp-2] | Integrated DNA Technologies | NA | F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA |
Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 11836170001 | |
Proteinase K | Bioline | BIO-37084 | |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 | |
RNAi-NGM plates | NA | NA | 1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG. |
RNase A | Sigma | R4642 | |
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma | L5777 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
SDS | Sigma | 74255 | Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature. |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month. |
Sonication Tube | Evergreen | 214-3721-010 | |
Sonication Tube Cap | Evergreen | 300-2911-020 | |
Sonicator | Qsonica | Q800R3-110 | |
Streptomycin sulfate | Bioshop | STP101 | Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C. |
TAE buffer (1X) | NA | NA | 40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA |
Tally counter clicker | Uline | H-7350 | |
Tetracycline | Bioshop | TET701 | Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C. |
Thermomixer | Eppendorf | 05-400-205 | |
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Invitrogen | 15568025 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature. |