İnsan Periferik Kanı Mononükleer Kaynaklı Makrofajlar İçinde Trichoderma stromaticum Conidia'nın Canlılık Testi
Summary
Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu makalenin amacı, Trichoderma stromaticum conidia ile uyarılan insan periferik kan mononükleer kaynaklı makrofajların fagositoz ve klirens yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunmaktır.
Abstract
Makrofajlar çok önemli bir savunma hattını temsil eder ve farklı dokularda patojenlerin büyümesini ve kolonizasyonunu önlemekten sorumludur. Konidyal fagositoz, makrofaj-patojen etkileşimlerinde yer alan sitoplazmik ve moleküler olayların araştırılmasına ve ayrıca içselleştirilmiş konidiaların ölüm zamanının belirlenmesine izin veren anahtar bir süreçtir. Mantar konidiasının makrofajlar tarafından fagositozunu içeren teknik, mantarlara karşı immün yanıtların modülasyonunu değerlendiren çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Fagositozdan kaçınma ve fagozomlardan kaçış mantar virülansının mekanizmalarıdır. Burada, biyokontrol ve biyogübre ajanı olarak kullanılan ve insan enfeksiyonlarını indükleyebilen bir mantar olan T. stromaticum conidia’nın fagositozu, klirensi ve canlılığının analizi için kullanılabilecek yöntemleri bildiriyoruz. Protokol şunlardan oluşur: 1) Trichoderma kültürü, 2) konidia elde etmek için yıkama, 3) polisakaroz çözelti yöntemi kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC’ler) izolasyonu ve PBMC’lerin makrofajlara farklılaşması, 4) yuvarlak cam lameller ve renklendirme kullanılarak bir in vitro fagositoz yöntemi ve 5) conidia fagositozundan sonra conidia canlılığını değerlendirmek için bir klirens testi. Özetle, bu teknikler makrofajların mantar temizleme etkinliğini ölçmek için kullanılabilir.
Introduction
Trichoderma cinsi (Sipariş: Hypocreales, Aile: Hypocreaceae), diğer mantar türlerinin parazitleri olan ve ticari olarak yararlı bir dizi enzim üretebilen her yerde bulunan, saprofitik mantarlardan oluşur1. Bu mantar türleri, heterolog proteinlerin2 üretiminde, selüloz3, etanol, bira, şarap ve kağıt4 üretiminde, tekstil endüstrisinde5, gıda endüstrisinde6 ve tarımda biyolojik kontrol ajanlarıolarak 7,8 kullanılmaktadır. Bu mantar türlerine olan endüstriyel ilgiye ek olarak, insanlarda artan enfeksiyon sayısı, bazı Trichoderma türlerine fırsatçı patojenlerin statüsünü vermiştir9.
Trichoderma spp. kültürde hızla büyür, başlangıçta yeşilimsi sarıdan koyu yeşile dönüşen beyaz ve pamuksu kolonilerbulunur 10. Çok çeşitli pH ve sıcaklık koşullarında yaşamaya adapte olmuşlardır ve fırsatçı türler fizyolojik pH ve sıcaklıklarda hayatta kalabilir ve böylece farklı insan dokularını kolonize edebilir 11,12,13. Daha da önemlisi, enfeksiyon oranındaki artış Trichoderma spp. virülans faktörleri ile ilişkili olabilir ve bunlar iyi çalışılmamıştır. Ek olarak, fırsatçı Trichoderma türlerine karşı bağışıklık tepkisini anlamaya odaklanan çalışmalar hala nadirdir.
Bir enfeksiyon sırasında, nötrofillerle birlikte, makrofajlar fagositozdan sorumlu savunma hattını temsil eder ve böylece farklı dokularda patojenlerin büyümesini ve kolonizasyonunu önler. Toll benzeri reseptörler ve C-tipi lektin reseptörleri, makrofajlar fagositoz mantarları gibi örüntü tanıma reseptörlerini kullanarak ve bunları fagolizozomlara işler, böylece solunum patlamasını, proinflamatuar sitokinlerin salınımını ve fagositozlu mikroorganizmaların yok edilmesini teşvik eder14. Bununla birlikte, fagositoz mekanizması, mantar hücrelerinin boyutu ve şekli gibi farklı mikrobiyal stratejilerden etkilenebilir ve önlenebilir; fagositozu engelleyen kapsüllerin varlığı; fagositozu indükleyen reseptörlerin sayısını azaltmak; sitoplazmadaki aktin liflerinin yapısının yeniden şekillenmesi; psödopodia oluşumunu engellemek; ve fagositoz işleminden sonra fagozom veya fagolizozom kaçar14.
Cryptococcus neoformans da dahil olmak üzere birçok patojen, konakçıda hayatta kalmak, yayılmak ve enfeksiyonu indüklemek için makrofajları bir niş olarak kullanır15. Fagositoz ve klirens testi, patojenlere karşı bağışıklık tepkisini değerlendirmek ve doğuştan gelen bağışıklık sisteminden kaçmak için kullanılan mikrobiyal stratejileri belirlemek için kullanılır 15,16,17. Bu tür bir teknik, fagositozun diferansiyel kinetiğini, gecikmiş fagozom asitlenmesini ve mantar öldürmesinin azalmasına neden olan oksidatif patlamayı incelemek için de kullanılabilir18.
Fagositoz, mantar sağkalımı ve fagozom olgunlaşma sürecinden kaçınmayı değerlendirmek için farklı yöntemler kullanılabilir. Bunlar arasında fagositozu, hücresel konumu ve fagositoz19 sırasında üretilen molekülleri gözlemlemek için kullanılan floresan mikroskobu; fagositoz hakkında nicel veriler sağlayan ve sürece dahil olan farklı belirteçleri değerlendirmek için kullanılan akış sitometrisi20,21; mikrobiyal yakalama ve fagozom olgunlaşmasını değerlendirmek için kullanılan intravital mikroskopi22; bir patojen23 için fagositoz sürecinin özgüllüğünü değerlendirmek için kullanılan antikor aracılı fagositoz; ve diğerleri 24,25,26,27.
Burada sunulan protokol, fagositozu ve mantar konidiasının öldürülmesini değerlendirmek için bir optik mikroskop ve plaka büyüme testi kullanan yaygın, düşük maliyetli ve doğrudan bir yöntem kullanır. Bu protokol, okuyuculara, T. stromaticum’a maruz kalan insan periferik kan mononükleer türevli makrofajları kullanarak fagositoz ve klirens testini gerçekleştirmek için adım adım talimatlar sağlayacaktır. PBMC’ler kullanıldı çünkü Trichoderma conidia, fitopatojenlere karşı bir biyokontrol ve dünya çapında bitki bitkileri için bir biyogübre olarak uygulandı ve Trichodermosis adı verilen çeşitli insan enfeksiyonlarına neden oldu. Bunun yanı sıra, Trichoderma conidia ile insan bağışıklık sistemi arasındaki etkileşime odaklanan, makrofajlardanötrofilleri 28 ve otofajları29 incelediğimiz sadece iki çalışma var. Bu makale ilk olarak PBMC’den türetilen makrofajlar tarafından T. stromaticum konidiasının fagositozunun nasıl incelenebileceğini ve daha sonra yutulan konidianın canlılığının basit mikroskopi tabanlı teknikler kullanılarak nasıl değerlendirilebileceğini göstermektedir. Bu protokol, makrofajla ilişkili immün yanıt veya immün sistem modülasyonu ile ilgili mekanizmalar hakkındaki araştırmaları daha da kolaylaştırabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli mantar patojenleri için, konidiyal veya maya fagositozu, makrofaj-patojen etkileşimlerinde sitoplazmik ve moleküler olayların araştırılmasına ve ayrıca içselleştirilmiş conidia’nın ölüm zamanının belirlenmesine izin veren anahtar bir süreçtir 14,39,40. Fagositoz, Trichoderma-host…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma aşağıdaki Brezilya finansman kurumları tarafından desteklenmiştir: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) RED0011/2012 ve RED008/2014 hibeleriyle. U.R.S., J.O.C. ve M.E.S.M. sırasıyla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ve FAPESB tarafından verilen bursu kabul eder.
Materials
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
| Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
| Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
| Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
| Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
| Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
| EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
| Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
| Flaticon | database of images | ||
| Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
| Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
| Image J | Image analysis software | ||
| Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
| Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
| Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
| Penicillin/Streptomycin Solution – 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
| Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
| Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
| Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
| Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |
References
- Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
- Nevalainen, H., Peterson, R., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 7 – Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 16 – Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 17 – Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 26 – Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A., Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. Chapter 24 – Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. , (2014).
- Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
- Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
- dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
- Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
- Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
- Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L., Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. , (2013).
- Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
- Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
- Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
- Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-17 (2011).
- Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
- Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
- Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
- Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
- Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
- Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
- Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
- Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
- Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
- dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
- Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
- Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
- Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
- Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
- Abedon, S. T., Bartom, E., Maloy, S., Hughes, K. Multiplicity of infection. Brenner’s Encyclopedia of Genetics. Second Edition. , (2013).
- Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
- Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
- Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
- Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
- Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health – Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
- Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
- Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
- Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
- Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
- Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
- Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
- Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
- Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day – Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
- Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
- Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
- Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).
