Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes

Die Gattung Trichoderma (Ordnung: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) besteht aus ubiquitären, saprophytischen Pilzen, die Parasiten anderer Pilzarten sind und in der Lage sind, eine Reihe kommerziell nützlicher Enzyme zu produzieren¹. Diese Pilzarten werden für die Herstellung von heterologen Proteinen², die Herstellung von Zellulose³, Ethanol, Bier, Wein und Papier⁴, in der Textilindustrie⁵, der Lebensmittelindustrie⁶ und in der Landwirtschaft als biologische Schädlingsbekämpfungsmittel ^7,8 verwendet. Neben dem industriellen Interesse an diesen Pilzarten hat die steigende Zahl von Infektionen beim Menschen einigen Trichoderma-Arten den Status opportunistischer Krankheitserreger verliehen⁹.

Trichoderma spp. wächst schnell in der Kultur, mit anfänglich weißen und watteartigen Kolonien, die sich grünlich-gelb bis dunkelgrün verfärben¹⁰. Sie sind an ein breites Spektrum von pH- und Temperaturbedingungen angepasst, und die opportunistischen Arten sind in der Lage, bei physiologischem pH-Wert und Temperaturen zu überleben und so verschiedene menschliche Gewebe zu besiedeln 11,12,13. Wichtig ist, dass der Anstieg der Infektionsrate von Trichoderma spp. mit Virulenzfaktoren in Verbindung gebracht werden kann, und diese sind nicht gut untersucht. Darüber hinaus sind Studien, die sich auf das Verständnis der Immunantwort gegen opportunistische Trichoderma-Arten konzentrieren, noch selten.

Während einer Infektion stellen Makrophagen zusammen mit Neutrophilen die Verteidigungslinie dar, die für die Phagozytose verantwortlich ist, und verhindern so das Wachstum und die Besiedlung von Krankheitserregern in verschiedenen Geweben. Mit Hilfe von Mustererkennungsrezeptoren, wie z. B. Toll-like-Rezeptoren und C-Typ-Lektinrezeptoren, phagozytieren Makrophagen Pilze und verarbeiten sie zu Phagolysosomen, wodurch ein Atemausbruch, die Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine und die Zerstörung der phagozytozytierten Mikroorganismen gefördert werden¹⁴. Der Mechanismus der Phagozytose kann jedoch durch verschiedene mikrobielle Strategien, wie z. B. die Größe und Form der Pilzzellen, beeinflusst und umgangen werden. das Vorhandensein von Kapseln, die die Phagozytose behindern; Verringerung der Anzahl der Phagozytose-induzierenden Rezeptoren; der Umbau der Struktur der Aktinfasern im Zytoplasma; Behinderung der Bildung von Pseudopodien; und Phagosom oder Phagolysosom entweichen nach dem Phagozytoseprozess¹⁴.

Viele Krankheitserreger, darunter Cryptococcus neoformans, nutzen Makrophagen als Nische, um im Wirt zu überleben, sich zu verbreiten und Infektionen zu induzieren¹⁵. Der Phagozytose- und Clearance-Assay wird verwendet, um die Immunantwort gegen Krankheitserreger zu bewerten und die mikrobiellen Strategien zu identifizieren, die eingesetzt werden, um das angeborene Immunsystem zu umgehen 15,16,17. Diese Art von Technik kann auch verwendet werden, um die differentielle Kinetik von Phagozytose, verzögerter Phagosomenversauerung und oxidativem Ausbruch zu untersuchen, die zu einer reduzierten Pilzabtötung führen¹⁸.

Verschiedene Methoden können verwendet werden, um die Phagozytose, das Überleben der Pilze und die Umgehung des Phagosomenreifungsprozesses zu bewerten. Dazu gehören die Fluoreszenzmikroskopie, mit der die Phagozytose, die zelluläre Lage und die während der Phagozytose produzierten Moleküle beobachtet^{werden 19}; Durchflusszytometrie, die quantitative Daten zur Phagozytose liefert und zur Bewertung der verschiedenen am Prozess beteiligten Marker verwendet wird^20,21; intravitale Mikroskopie, die zur Beurteilung des mikrobiellen Einfangs und der Phagosomenreifung verwendet wird²²; Antikörper-vermittelte Phagozytose, die verwendet wird, um die Spezifität des Phagozytoseprozesses für einen Krankheitserreger zu beurteilen²³; und andere 24,25,26,27.

Das hier vorgestellte Protokoll verwendet eine gängige, kostengünstige und direkte Methode, bei der ein optisches Mikroskop und ein Plattenwachstumsassay verwendet werden, um die Phagozytose und Abtötung von Pilzkonidien zu beurteilen. Dieses Protokoll bietet den Lesern Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung des Phagozytose- und Clearance-Assays mit mononuklearen Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut, die T. stromaticum ausgesetzt sind. PBMCs wurden verwendet, weil Trichoderma-Konidien als biologischer Schädlingsbekämpfungsmittel gegen Phytopathogene und als Biodünger für Pflanzenkulturen weltweit eingesetzt werden und mehrere Infektionen beim Menschen verursacht haben, die als Trichodermose bezeichnet werden. Darüber hinaus gibt es bisher nur zwei Arbeiten, die sich mit der Interaktion zwischen Trichoderma conidia und dem menschlichen Immunsystem befassen, in denen wir Neutrophile²⁸ und Autophagie in Makrophagen²⁹ untersucht haben. Dieser Artikel zeigt zunächst, wie die Phagozytose der Konidien von T. stromaticum durch PBMC-abgeleitete Makrophagen untersucht werden kann, und dann, wie die Lebensfähigkeit der verschlungenen Konidien mit einfachen mikroskopiebasierten Techniken beurteilt werden kann. Dieses Protokoll kann Untersuchungen zur Makrophagen-assoziierten Immunantwort oder zu Mechanismen im Zusammenhang mit der Modulation des Immunsystems weiter erleichtern.