تحضير كامل قائم على الميثانول لفحص خلايا العقدة الشبكية
Summary
يمكن استخدام الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات الشبكية الكاملة والتخزين طويل الأجل ، وهو أمر مفيد لفحص خلايا العقدة الشبكية.
Abstract
تنشر خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، وهي الخلايا العصبية الإسقاطية للشبكية ، المعلومات البصرية الخارجية إلى الدماغ. التغيرات المرضية في RGCs لها علاقة وثيقة مع العديد من الأمراض التنكسية في شبكية العين. كثيرا ما يستخدم التلطيخ المناعي الكامل للشبكية في الدراسات التجريبية على RGCs لتقييم الظروف التنموية والمرضية للشبكية. في ظل بعض الظروف ، قد تحتاج بعض عينات شبكية العين القيمة ، مثل تلك المأخوذة من الفئران المعدلة وراثيا ، إلى الاحتفاظ بها لفترة طويلة دون التأثير على مورفولوجيا أو عدد RGCs. للحصول على نتائج تجريبية موثوقة وقابلة للتكرار ، يعد استخدام وسيط حفظ فعال أمرا ضروريا. هنا ، نصف تأثير الميثانول كوسيط ثابت مساعد لمستحضرات شبكية العين الكاملة والتخزين طويل الأجل. باختصار ، أثناء عملية العزل ، يتم سحب الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) على سطح الشبكية للمساعدة في إصلاح الأنسجة وتسهيل نفاذيتها ، ومن ثم يمكن تخزين شبكية العين في الميثانول البارد (-20 درجة مئوية) قبل أن تكون مناعية. يصف هذا البروتوكول سير عمل عزل الشبكية وبروتوكول تخزين عينات الأنسجة ، وهو أمر مفيد وعملي للتحقيق في RGCs.
Introduction
خلايا العقدة الشبكية (RGCs) هي الخلايا العصبية الإسقاطية الوحيدة في شبكية العين ، وهي تدمج وتنقل المعلومات المرئية الخارجية إلى الدماغ1. تتميز العديد من الأمراض التنكسية العصبية مثل الجلوكوما والاعتلال العصبي البصري الرضحي بأضرار لا رجعة فيها وفقدان RGCs 2,3. يعد تحليل التغيرات المورفولوجية والكمية ل RGCs خطوة حاسمة في تحديد كيفية تطور الأمراض التنكسية العصبية وتقدمها 4,5.
مقايسة التألق المناعي غير المباشر هي طريقة مقبولة على نطاق واسع لمراقبة توزيع البروتينات وعدد الخلايا. في المختبر ، يشيع استخدام التلطيخ المناعي الكامل للشبكية في الدراسات التجريبية على RGCs لتقييم الظروف الفسيولوجية والمرضية لشبكية العين6. تشمل العلامات الأكثر شيوعا المستخدمة في القياس الكمي ل RGC في شبكية العين بأكملها Brn3a ، بروتين ربط الحمض النووي الريبي مع الربط المتعدد (RBPMS) ، وما إلى ذلك 7,8. يتطلب توصيف كمية وتوزيع RGCs تلطيخا مناعيا عالي الجودة للشبكية بالكامل. بشكل عام ، في بروتوكولات التلوين المناعي ، يتم غمر شبكية العين في المثبتات الكيميائية قبل تحضينها في الأجسام المضادة. يجب ألا تغير المثبتات المثالية شكل الخلايا ، أو إمكانية الوصول أو تقارب الحواتم للأجسام المضادة ، أو الأبعاد الخطية للأنسجة 9,10.
نظرا للبنية المعقدة للشبكية ، فإن مشاكل مثل هشاشة الشبكية وطيها ، بالإضافة إلى بعض الصعوبات الشائعة بما في ذلك انكماش الخلايا والنوى غير الواضحة ، عرضة للحدوث عند صنع رقعة شبكية كاملة ، والتي لها تأثير سلبي على البحث التجريبي. بالإضافة إلى ذلك ، ليست كل شبكية العين ملطخة بالمناعة على الفور ، خاصة عندما يتعلق الأمر بشبكية الفئران المعدلة وراثيا بأسعار باهظة الثمن ذات أصل ثمين ، مما يستلزم الحفاظ على عينات الشبكية الإضافية لاستخدامها مرة أخرى.
يمكن للحل المثبت المناسب إصلاح الأنسجة بسرعة ، وتجنب التحلل الذاتي للأنسجة ، والحفاظ على التشكل الطبيعي وهيكل خلايا الأنسجة ، والحفاظ على مستضدية البروتينات والمواد الأخرى10. في الوقت الحاضر ، تم استخدام التثبيت القائم على الفورمالديهايد على نطاق واسع في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك شبكية العين المنفصلة ، وأكواب العين الدموية ، ومقل العيون الكاملة10. انكماش الأنسجة والتغيير المورفولوجي للخلايا هما التحديان الحاسمان اللذان تمت مواجهتهما بعد الغمر في الفورمالديهايد11. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر تركيبات التثبيت المعدلة بشكل متزايد لزيادة الاحتفاظ بالخصائص الأصلية لشبكية العين والخلايا المستهدفة 9,10. قد تؤثر علاجات تثبيت الشبكية المختلفة على بنية الشبكية ، ومناعة البروتين ، والإثارة الفلورية ، ودورة تبريد التوهين بشكل مختلف12,13. شبكية العين المثبتة بمحلول ديفيدسون أكثر سلامة من الناحية الشكلية مقارنة بتلك المثبتة بالفورمالين ، لكن محلول ديفيدسون أقل توافقا مع بعض الأجسام المضادة ، مثل جزيء محول ربط الكالسيوم المتأين بعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة 112. بالنظر إلى الطبيعة الهشة لشبكية العين ، سيتساءل الباحثون بطبيعة الحال عما إذا كانت سلامة الشبكية ، وكذلك خصائص وشكل الخلايا المستهدفة ، ستتغير بعد التخزين على المدى الطويل. ومع ذلك ، نادرا ما تم الإبلاغ عن الآثار المحتملة لمحلول التثبيت على مورفولوجيا خلايا الشبكية و RGC بعد التخزين لعدة أشهر. يعد تحسين تثبيت الشبكية أمرا بالغ الأهمية لتقييم وحفظ RGCs.
نحن نقدم وصفا مفصلا لطريقة موثوقة ومباشرة من الناحية الفنية نستخدمها لتلطيخ شبكية الفئران بالكامل. تؤكد طريقتنا على التحضير والتخزين المناسبين لشبكية العين لفحص RGC ، مع الأخذ في الاعتبار الحاجة إلى التخزين طويل الأجل لأنسجة الشبكية بالإضافة إلى جوانب محددة من تكوين الفلوروفور أو تدهوره.
Protocol
Representative Results
Discussion
التثبيت هو خطوة أساسية للحفاظ على شبكية العين ، والتي يمكن أن تؤثر على أي تحقيقات RGC لاحقة بناء على التشكل. يلتقط التثبيت الناجح بسرعة بنية وحالة شبكية العين في لحظة تعريضها لوسط التثبيت ، وهو أمر بالغ الأهمية لمزيد من التحليل. على الرغم من أن الفورمالديهايد يعتبر أحد أكثر عوامل التثبيت شي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل مشروع افتتاح مختبرات هوبي الرئيسية (المنحة رقم 2021KFY055) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هوبي (منحة رقم 2020CFB240) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (منحة رقم 2042020KF0065).
Materials
| 24-well cell culture cluster | Costar | Eyeball fixation | |
| 24-well hemagglutination plate | Labedit Company | Incubation antibody | |
| Adhesion microscope slides | Citotest | Or similar | |
| Anti-fluorescent quenching mountant | Servicebio | G1401 | Slow down fluorescence quenching |
| BSA (bovine serum albumin) | Servicebio | GC305010 | Blocking reagent |
| Confocal microscope | OLYMPUS | Apply 40x objective lens | |
| Curved scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Dissecting microscope | RWD Life science Co.,LTD | 77001S | Dissecting tools |
| Forceps | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools | |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20210624 | GC≥99.5% |
| Nail polish | SecheVite | Sealing agent | |
| Needles | Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. | Accelerate the fixation | |
| Paraformaldehyde solution | Servicebio | G1101 | Eyeball fixation |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Servicebio | G0002 | Rinse the eyeball |
| Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) | PhosphoSolutions | Cat. #1832-RBPMS | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-165-148 | For immunofluorescence. Used at 1:400 |
| Straight scissors | Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. | Dissecting tools |
References
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: Current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (2), 152-181 (2012).
- Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Neuroinflammation, microglia and implications for retinal ganglion cell survival and axon regeneration in traumatic optic neuropathy. Frontiers in Immunology. 13, 860070 (2022).
- Pavlidis, M., Stupp, T., Naskar, R., Cengiz, C., Thanos, S. Retinal ganglion cells resistant to advanced glaucoma: A postmortem study of human retinas with the carbocyanine dye DiI. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (12), 5196-5205 (2003).
- Vidal-Sanz, M., et al. Understanding glaucomatous damage: anatomical and functional data from ocular hypertensive rodent retinas. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (1), 1-27 (2012).
- Kole, C., et al. Activating transcription factor 3 (ATF3) protects retinal ganglion cells and promotes functional preservation after optic nerve crush. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 31 (2020).
- Nadal-Nicolás, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: A new marker for retinal ganglion cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
- Stradleigh, T. W., Greenberg, K. P., Partida, G. J., Pham, A., Ishida, A. T. Moniliform deformation of retinal ganglion cells by formaldehyde-based fixatives. Journal of Comparative Neurology. 523 (4), 545-564 (2015).
- Bucher, D., Scholz, M., Stetter, M., Obermayer, K., Pflüger, H. J. Correction methods for three-dimensional reconstructions from confocal images: I. Tissue shrinking and axial scaling. Journal of Neuroscience Methods. 100 (1-2), 135-143 (2000).
- Chidlow, G., Daymon, M., Wood, J. P., Casson, R. J. Localization of a wide-ranging panel of antigens in the rat retina by immunohistochemistry: Comparison of Davidson’s solution and formalin as fixatives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (10), 884-898 (2011).
- Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: A comparison with Davidson’s fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
- Miki, M., Ohishi, N., Nakamura, E., Furumi, A., Mizuhashi, F. Improved fixation of the whole bodies of fish by a double-fixation method with formalin solution and Bouin’s fluid or Davidson’s fluid. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (3), 201-206 (2018).
- Zanini, C., Gerbaudo, E., Ercole, E., Vendramin, A., Forni, M. Evaluation of two commercial and three home-made fixatives for the substitution of formalin: A formaldehyde-free laboratory is possible. Environmental Health. 11, 59 (2012).
- Tang, M., et al. An optimized method to visualize the goblet cell-associated antigen passages and identify goblet cells in the intestine, conjunctiva, and airway. Immunobiology. 227 (6), 152260 (2022).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
- Baykal, B., Korkmaz, C., Kocabiyik, N., Ceylan, O. M. The influence of post-fixation on visualising vimentin in the retina using immunofluorescence method. Folia Morphologica. 77 (2), 246-252 (2018).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nature Protocols. 7 (6), 1086-1096 (2012).
- Zhang, N., Cao, W., He, X., Xing, Y., Yang, N. Using methanol to preserve retinas for immunostaining. Clinical and Experimental Ophthalmology. 50 (3), 325-333 (2022).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3847-3857 (2012).
- Parrilla-Reverter, G., et al. Time-course of the retinal nerve fibre layer degeneration after complete intra-orbital optic nerve transection or crush: a comparative study. Vision Research. 49 (23), 2808-2825 (2009).
