종양 미세 환경의 임상 및 생물학적 평가를 위한 공간 이미지 분석과 결합된 Multiplex Immunofluorescence

현재 프로토콜에 사용된 모든 샘플은 지역 윤리 위원회의 승인을 받고 관할 당국의 승인을 받은 연구에서 나왔습니다. 연구에 참여한 모든 참가자는 서면 동의서를 제공했습니다. 평가판은 ClinicalTrials.gov(NCT03608046)에 등록됩니다. 1. 멀티플렉스 면역형광 FFPE 절편조직을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 고정 조직을 파라핀에 묻습니다. 5μm 섹션을 절단하여 접착 현미경 슬라이드에 놓습니다. 슬라이드를 실온(RT)에서 밤새 건조시킵니다. 탈파라핀화 및 내인성 과산화효소 억제슬라이드를 톨루엔(각각 5분 동안 3회)과 메탄올(5분 동안 각각 3회)에 담가 조직을 흄 후드 아래에 담가 조직을 탈랍합니다. 슬라이드를 흄 후드 아래에서 20분 동안 메탄올에 희석된 3% 과산화수소에 담가 내인성 과산화효소를 억제합니다. 슬라이드를 증류된 (d)H2O(3분 동안 1x)로 헹굽니다. Multiplex immunofluorescence staining (멀티플렉스 면역형광 염색)0.1% TritonX-100이 첨가된 10mM 구연산염(pH 6) 또는 EDTA(pH 9) 완충액이 들어 있는 300mL 염색 용기에 슬라이드를 담급니다.참고: 사용된 완충액(pH 6 또는 pH 9)은 염색된 항원에 따라 다릅니다( 표 1 참조). 완충액이 끓기 시작할 때까지 뚜껑을 닫은 염색 용기를 전자레인지에 최대 전력(예: 900W)으로 3-5분 동안 둡니다.알림: 최적의 끓는 시간은 전자레인지와 버퍼의 부피에 따라 다릅니다. 완벽한 타이밍을 찾기 위해 조정이 필요할 수 있습니다. 일부 깨지기 쉬운 항원 또는 깨지기 쉽고 접착력이 낮은 표본(예: 오가노이드 및 스페로이드)의 경우 전자레인지 끓임이 너무 가혹할 수 있습니다. 이 경우 압력솥을 대신 사용할 수 있습니다. 밀폐된 염색 용기를 전자레인지에 넣고 저전력(예: 90W)으로 15분 동안 버퍼를 거의 끓는 온도로 유지합니다. 전자레인지를 90초 동안 최대 전력으로 설정하여 가열의 마지막 단계를 수행합니다. 전자레인지에서 항아리를 꺼내고 버퍼를 RT에서 15분 동안 식힙니다. 슬라이드를dH2O중에서 각각 5분 동안 3x 헹구고, 0.1% 트윈 20 (TBS-T)을 함유하는 트리스-완충 식염수에서 5분 동안 1x 헹굽니다. 종이 타월로 슬라이드를 닦아 TBS-T를 제거합니다. 슬라이드(평평한)를 염색 챔버 트레이 또는 현미경 슬라이드 상자에 놓습니다( 재료 표 참조). 소수성 펜으로 조직을 둘러 쌉니다. TBS-T에 용해된 5% 소혈청알부민(BSA)으로 조직을 30분 동안 덮어 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 종이 타월에 슬라이드를 닦아 차단 버퍼를 제거합니다.알림: 차단 단계 후에 슬라이드를 헹구지 마십시오. 약 300μL의 용액으로 조직을 덮음으로써 1% BSA TBS-T에 희석된 1차 항체( 표 1 참조)와 함께 60분 동안 조직을 배양합니다. TBS-T로 슬라이드를 각각 3분 동안 3번 헹굽니다. 약 300 μL의 용액으로 조직을 덮음으로써 poly-HRP 2차 항체( 표 1 참조)로 40분 동안 조직을 인큐베이션합니다. TBS-T로 슬라이드를 3분 동안 3번 헹굽니다. 0.003%H2O2로 즉석에서 보충된 붕산염 완충액(0.1 M borate, pH 7.8, 3 M NaCl)에 200배 희석된 형광색소 티라미드 시약(표 1 참조)으로 조직을 약 300 μL의 용액으로 덮음으로써 조직을 10분 동안 인큐베이션한다. TBS-T로 슬라이드를 3분 동안 3번 헹굽니다. 모든 TSA 염색이 수행될 때까지 1.3.1-1.3.16 단계를 반복합니다. 조직을 1% BSA TBS-T에 희석된 마지막 1차 항체( 표 1 참조)와 함께 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.참고: 배양은 하룻밤 사이에 이루어지기 때문에 염색 챔버 트레이 또는 현미경 슬라이드 상자를 덮고 상자 바닥(슬라이드 아래)의 종이 타월에 dH2O를 추가하여 배양 중에 조직이 건조하지 않도록 하는 것이 중요합니다. TBS-T로 각각 5분 동안 티슈를 3번 헹굽니다. 1% BSA TBS-T에서 200배 희석된 2차 항체(형광색소와 직접 결합)로 120분 동안 조직을 배양합니다. TBS-T로 각각 5분 동안 티슈를 3번 헹굽니다. 조직을 10% BSA TBS-T에 1,000배 희석한 비스벤지미드(20mM)에서 5분 동안 배양하여 핵을 염색합니다.알림: 비스벤지미드는 DAPI로 대체할 수 있지만 후자는 더 독성이 강하므로 흄 후드 아래에서 조심스럽게 다루어야 합니다. 티슈를dH2O에서 각각 3분 동안 3회 헹굽니다. 형광 장착 매체와 붕규산 커버 유리를 사용하여 슬라이드를 장착합니다. 2. 슬라이드 스캔 형광 슬라이드 스캐너에서 20x 배율로 슬라이드를 스캔하여 디지털화합니다(슬라이드 스캐너에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있음).참고: 최적의 멀티플렉스의 대표적인 스캔이 그림 1에 나와 있습니다. 3. 이미지 분석 스캔을 이미지 분석 소프트웨어로 가져옵니다(파일 > 이미지 열기). 분류자 탭으로 이동하여 DenseNet AI V2 플러그인을 선택합니다. 하나의 이미지에서 약 500개의 핵을 둘러싸서 핵을 인식하도록 DenseNet AI V2 플러그인을 훈련시킵니다. 여러 슬라이드(약 10개)에서 여러 핵(50)을 둘러싸서 동일한 배치와 mIF 염색의 다른 배치에서 여러 슬라이드에 AI를 훈련합니다.참고: AI 플러그인 사용 방법에 대한 자세한 지침은 소프트웨어 설명서에서 찾을 수 있습니다. 핵 검출에 AI를 사용하는 것은 선택 사항입니다. 핵을 검출하는 다른 방법은 사용되는 이미지 분석 소프트웨어에 따라 사용할 수 있습니다. 학습된 AI를 저장합니다(분류자 작업 > 저장). 주석 탭으로 이동하고 펜 주석 도구를 사용하여 종양의 중심 및 종양의 가장자리와 같은 각 관심 영역(ROI)에 대한 주석을 만듭니다. 필요한 경우 제외 주석 도구를 사용하여 접힌 영역과 흐리게 나타나는 영역을 제거합니다.참고: mIF에 사용된 섹션에 인접한 섹션의 헤마톡실린-에오신 염색은 mIF 염색 전에 수행하여 종양 세포가 표본에 존재하는지 확인하고 해부병리학자가 ROI를 결정하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 분석(Analysis) 탭으로 이동하여 HighPlex FL 알고리즘(HighPlex FL> 로드 > 설정 작업)을 선택합니다. 염료 선택 탭을 선택하고 원하는 염료를 선택합니다. Nuclear Detection(핵 탐지 ) 탭에서 Nuclear Segmentation Type(핵 분할 유형)으로 이동하고 AI custom(AI 사용자 지정)을 선택합니다. Nuclear Segmentation Classifier에서 3.5단계에서 저장한 AI를 선택합니다. Membrane and Cytoplasm Detection(막 및 세포질 검출) 탭에서 최대 세포질 반경(이 연구에서는 1.5가 사용됨)과 막 염료의 수를 선택했습니다. 각 염료에 대해 핵 양성 역치, 세포질 양성 역치 및 막 양성 역치를 선택합니다.참고: 임계값은 각 염색마다 다르며 슬라이드의 각 배치와 염색된 각 항원에 대해 조정해야 합니다. 보기 설정 도구(보기 > 보기 설정)를 사용하면 강도 피크 끝(오른쪽)에 있는 강도 값을 사용하여 적절한 임계값을 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다. 각 염료에 대해 핵, 막 및 세포질 완전성 백분율 값을 선택합니다.참고: 이 매개변수는 염색이 다른 두 세포가 서로 가까이 있을 때 위양성 검출을 방지하는 데 중요합니다(그림 2). 알고리즘을 저장합니다(설정 작업 > 저장). ROI를 분석합니다(주석 레이어 분석>). 결과 탭으로 이동하여 개체 데이터(ctrl + A)의 모든 데이터를 선택합니다. 데이터를 .csv 형식으로 내보냅니다(마우스 오른쪽 버튼을 클릭하거나 > Object Data 내보내기> . Csv)입니다.참고: 이 표에는 위치(Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) 및 각 분석된 세포의 각 마커의 양성을 나타내었다. 4. R을 이용한 생물정보학 참고: 다음 단계에 대한 자세한 내용을 제공하는 R 스크립트는 GitHub(benidovskaya/Ring: Pipeline for the analysis of multiplex immunofluorescence stainings)에서 사용할 수 있습니다. [github.com]) 내보낸 표를 사용하여 먼저 colocalization 염색을 기반으로 다양한 세포 유형을 정의합니다. 예를 들어, 이중 양성 CD3+/CD8+ 세포에 의한 세포독성 T 세포를 정의합니다. 그런 다음 이미지 분석 소프트웨어에서 내보낸 좌표와 ggplot2(그림 3). 이러한 데이터를 사용하여 다음과 같은 여러 유형의 분석을 수행할 수 있습니다.밀도 분석참고: 가장 간단한 분석은 밀도 분석입니다.생검을 위해 전체 슬라이드 또는 조직의 특정 영역을 사용하여 모든 세포 유형에 대한 밀도 분석을 수행합니다. 예를 들어, 종양의 중심과 종양의 가장자리에 있는 CD3+ 및 CD8+ T 세포의 밀도를 계산합니다(그림 4A-C). 이러한 밀도를 계산하려면 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 세포의 표현형과 좌표로 샘플당 특정 데이터 프레임을 생성합니다. R의 클러스터링 함수(k-최근접 이웃)를 통해 연구된 생검의 경계를 사용하여 다각형 객체를 만들고 그 안에 있는 관심 세포 유형의 밀도를 계산합니다.참고: 이를 통해 생물학적 가설에 따라 다양한 조건(예: 다른 시점, 치료 유형, 조직 유형 및 치료에 대한 반응)과 국소화(종양 중심, 종양 가장자리, 간질 섬유증 및 괴사 영역) 간에 서로 다른 세포 유형의 밀도를 비교할 수 있습니다. 암세포, 종양주위 세포, 종양 침윤 세포 사이의 근접성이 높기 때문에 이미지 분석 소프트웨어는 이중 양성 세포를 면역과 암세포로 동시에 검출할 수 있습니다. 이 경우 이러한 이중 양성 세포가 무엇인지 언급하여 이 문제를 생물학적으로 수정해야 합니다. 이 경우 CD3+CD8+사이토케라틴+ 세포는 침윤 림프구를 둘러싼 종양 세포로 인해 사이토케라틴 양성이 발생했기 때문에 세포독성 세포로 태그되었습니다. 히트맵서로 다른 패널의 각 세포 유형 밀도를 사용하고 정규화(예: 스케일링 센터링)를 적용하여 샘플 모집단의 세포 풍부도를 나타내는 히트맵(그림 5)을 그립니다. 세포 밀도를 기반으로 하는 계층적 비지도 클러스터링을 사용하여 유사한 TME 구성을 가진 환자를 클러스터링하고 이러한 클러스터를 치료 반응 및 생존과 같은 임상 매개변수와 연관시킵니다.참고: 히트맵 및 클러스터화는 R ComplexHeatmap 패키지9를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 공간 세포 분포세포 사이의 거리를 생물정보학적으로 계산(예: 면역 및 종양 세포; 도 6A, B)는 이미지 분석에 의해 제공된 세포 좌표를 기반으로 한다. 관심 있는 세포 유형 간의 중위수 및 평균 거리를 사용하여 코호트의 모든 샘플에서 세포 근접성을 비교합니다. 공간 설명 함수R 스패스탯 패키지(10)를 통해 이용가능한 교차형 최근접 이웃 G-교차 함수를 사용하여, 관심 세포 X(예를 들어, 종양 세포)가 세포 X 주위의 특정 반경 내에서 가장 가까운 세포 Y(예를 들어, T 세포)를 만날 확률을 결정한다. 경험적 곡선 아래 면적을 계산하여 종양 세포 주위의 CD3+ T 세포의 종양 침윤을 나타내는 수치를 얻습니다(그림 6C). F-함수 또는 J-함수12와 같은 다른 공간 설명 함수를 사용합니다. 면역 점수 분석종양 중앙과 종양의 침습성 가장자리에 있는 CD3+ 및 CD8+ T 세포의 밀도를 사용하여 Galon 7,8 팀이 개발한 Immunoscore(I)를 계산합니다.참고: 점수 범위는 I0에서 I4까지입니다. 종양의 중앙과 가장자리에 있는 CD3+ 및 CD8+ T 세포의 낮은 밀도는 I0의 점수와 관련이 있는 반면, 두 영역 모두에서 CD3+ 및 CD8+ T 세포의 높은 밀도는 I4의 점수와 관련이 있습니다. 최근 면역코어의 예후 영향은 13개국 14개 센터에서 실시한 I-III기 대장암 환자 2,681명의 샘플을 대상으로 한 연구에서 검증되었다7. 그러나 계산하기 위해 Immunoscore는 종양의 중심과 가장자리를 모두 포함하는 외과적으로 절제된 표본이 필요합니다. 일반적으로 마진이 없는 생검의 경우, 생검 적응 면역점수(Immunoscore)가 최근 개발되었다13. 생검 적응 면역 점수를 계산하려면 CD3+ 및 CD8+ T 세포 밀도 값을 백분위수로 변환한 다음 CD3+ 및 CD8+ T 세포의 평균 백분위수를 사용하여 세 가지 범주(즉, 낮음, 중간 및 높음) 중 하나로 점수를 매깁니다13. 핫스팟 분석quadratcount 함수(spatstat)10를 사용하여 핫스팟 분석을 사용하여 조직의 가장 침윤된 영역에서 다양한 세포 유형의 밀도를 비교합니다. 예를 들어, 조직의 가장 침윤된 사각형의 CD3 및 CD8 T 세포 밀도 값을 사용하여 “Immunoscore-like” 점수를 계산할 수 있습니다(그림 7). 조직 전체에 걸쳐 불균일한 분포를 가진 모든 세포 유형의 분석에 이 방법을 적용합니다.