Summary

Beteendekarakterisering av en musmodell med Angelmans syndrom

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

Detta manuskript presenterar en uppsättning mycket reproducerbara beteendetester för att validera en musmodell med Angelmans syndrom.

Abstract

Detta manuskript beskriver ett batteri av beteendetester som finns tillgängliga för att karakterisera Angelmans syndrom (AS)-liknande fenotyper i en etablerad musmodell av AS. Vi använder rotarodinlärningsparadigmet, detaljerad gånganalys och bobyggnadstest för att upptäcka och karakterisera motoriska nedsättningar hos djur. Vi testar djurens emotionalitet i det öppna fältet och förhöjda plus labyrinttester, samt effekten i svansupphängningstestet. När AS-möss testas i det öppna fälttestet bör resultaten tolkas med försiktighet, eftersom motoriska dysfunktioner påverkar musens beteende i labyrinten och förändrar aktivitetspoängen.

Reproducerbarheten och effektiviteten hos de presenterade beteendetesterna har redan validerats i flera oberoende Uba3a-muslinjer med olika knockout-varianter, vilket gör denna uppsättning tester till ett utmärkt valideringsverktyg inom AS-forskning. Modeller med relevant konstrukt- och ansiktsvaliditet kommer att motivera ytterligare undersökningar för att belysa sjukdomens patofysiologi och möjliggöra utveckling av kausala behandlingar.

Introduction

Angelmans syndrom (AS) är en sällsynt utvecklingsneurologisk funktionsnedsättning. Det vanligaste genetiska ursprunget till AS är en stor deletion av 15q11-q13-regionen i den maternella kromosomen, som finns hos nästan 74 % av patienterna1. Deletion av denna region orsakar förlust av UBE3A, den huvudsakliga orsakande genen för AS som kodar för ett E3 ubiquitinligas. Den faderliga allelen av UBE3A-genen i nervceller tystas i en process som kallas prägling. Som en följd av detta tillåter faderns prägling av genen endast moderns uttryck i det centrala nervsystemet (CNS)2. Därför leder UBE3A-gendeletion från den maternella kromosomen till utveckling av AS-symtom. Hos människa manifesterar sig AS vid cirka 6 månaders ålder, med utvecklingshämning som kvarstår under alla utvecklingsstadier och resulterar i allvarliga försvagande symtom hos drabbade individer 3,4. De viktigaste symtomen på sjukdomen är nedsatt fin- och grovmotorik, inklusive ryckig ataktisk gång, allvarlig talstörning och intellektuell funktionsnedsättning. Cirka 80 % av AS-patienterna lider också av sömnstörningar och epilepsi. Hittills är den enda tillgängliga behandlingen symtomatiska läkemedel, som minskar epileptiska anfall och förbättrar sömnkvaliteten1. Därför kommer utvecklingen av robusta djurmodeller med reproducerbara beteendefenotyper tillsammans med förfinad fenotypningsanalys att vara avgörande för att belysa de patofysiologiska mekanismerna för sjukdomen och upptäcka effektiva mediciner och behandlingar.

Komplexiteten i den mänskliga störning som påverkar CNS kräver att modellorganismer har ett jämförbart genom, fysiologi och beteende. Möss är populära som modellorganismer på grund av deras korta reproduktionscykel, lilla storlek och relativt enkla DNA-modifiering. År 1984 föreslog Paul Willner tre grundläggande kriterier för validering av sjukdomsmodeller: konstruktionen, ansiktet och den prediktiva validiteten, som används för att bestämma modellens värde5. Enkelt uttryckt återspeglar begreppsvaliditet de biologiska mekanismer som är ansvariga för sjukdomsutvecklingen, ansiktsvaliditet rekapitulerar dess symtom och prediktiv validitet beskriver modellsvaret på terapeutiska läkemedel.

För att följa ovanstående principer har vi valt den vanligaste genetiska etiologin, en stor deletion av maternella 15q11.2-13q-lokus inklusive UBE3A-genen, för att skapa AS-modellmöss. Vi använde CRISPR/Cas9-tekniken för att ta bort ett 76 225 bp långt område som spänner över hela UBE3A-genen, som omfattar både de kodande och icke-kodande elementen i genen, i möss från en C57BL/6N-bakgrund6. Vi avlade sedan djuren för att få UBE3A+/− heterozygota möss. För ansiktsvalidering av modellen använde vi djur från korsningar av UBE3A+/ honor och vildtypshanar för att få UBE3A+/- avkomma (stam med namnet C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph och senare tilldelad UBE3A mGenedel/+) och kontrollera kullsyskon. Vi testade deras fin- och grovmotorik, känslosamhet och affekt för att rekapitulera AS-symtomen. I en tidigare artikel utvärderade vi även djurens kognitiva funktioner, då AS-patienter också lider av intellektuell funktionsnedsättning6. Vi fann dock inga kognitiva försämringar hos UBE3AmGenedel/+-möss, kanske på grund av djurens unga ålder vid tidpunkten för test7. Senare undersökning av de äldre djuren, cirka 18 veckor gamla, avslöjade ett underskott i beteendemässig flexibilitet under reverseringsinlärning i platspreferensparadigmet. Komplexiteten hos den utrustning som används för denna analys kräver dock en separat metodologisk modul och den ingår inte här.

De beteendetester som presenteras här tillhör de vanligaste fenotypningsverktygen inom genetisk forskning, tack vare deras höga prediktiva värde och tillräckliga konstruktvaliditet 8,9,10. Vi använde dessa tester för att validera en musmodell av AS genom att rekapitulera kärnsymtom på den mänskliga sjukdomen på ett reproducerbart, åldersoberoende sätt. Djurets emotionalitet utvärderades i den förhöjda plus labyrinten och de öppna fälttesterna. Båda dessa tester är baserade på konflikten mellan närmande och undvikande, där djur utforskar en ny miljö på jakt efter mat, skydd eller parningsmöjligheter samtidigt som de undviker ångestfyllda fack11. Dessutom används det öppna fälttestet för att testa en mus motoriska aktivitet8. Svansupphängningstestet används ofta inom depressionsforskning för att screena för nya antidepressiva läkemedel eller depressiva fenotyper i musknockoutmodeller12. Detta test utvärderar den förtvivlan som djur utvecklar över tid i en oundviklig situation. Motorisk inlärning och detaljerade gångegenskaper bestämdes på rotarod respektive i DigiGait. Djurens uthållighet på den accelererande staven kännetecknar dess balans- och rörelsekoordinationsförmåga, medan detaljerad analys av en mus stegmönster är en känslig utvärdering av neuromuskulära funktionsnedsättningar kopplade till många neurogenerativa rörelsestörningar13,14,15. Fragmenteringstestet är en del av standardmetoden för att upptäcka impulsivt beteende hos gnagare, och eftersom det använder naturligt gnagarbyggande beteende indikerar det djurets välbefinnande16,17.

Storleken på försöksgrupperna var ett resultat av en kompromiss för att uppfylla kraven på 3R-regeln och effektiv användning av bisamhällenas avelsprestanda. För att få statistisk styrka hade grupperna dock inte mindre än 10 individer, på grund av att det fanns tillräckligt många häckande par. Dessvärre resulterade avelsresultaten inte alltid i ett tillräckligt antal djur.

Protocol

Alla djur och försök som användes i denna studie genomgick etisk granskning och utfördes i enlighet med det europeiska direktivet 2010/63/EU. Studien har godkänts av den tjeckiska centralkommissionen för djurskydd. Mössen hölls i individuellt ventilerade burar och hölls vid en konstant temperatur på 22 ± 2 °C med en 12 timmars ljus/mörker-cykel. Mössen försågs med musmat och fritt vatten. Mössen hölls i grupper om tre till sex djur per bur. Ingen annan hantering än vägning utfördes före pro…

Representative Results

Förhöjd plus labyrint och öppna fälttesterEPM- och OF-testerna använder gnagares naturliga tendens att utforska nya miljöer18,19. Utforskandet styrs av en närmande-undvikande konflikt, där gnagare väljer mellan att utforska en ny miljö och att undvika eventuell fara. Djur utforskar okända platser i jakt på skydd, social kontakt eller födosök. Nya platser kan dock innebära riskfaktorer som rovdjur eller konkurrenter. Både OF-te…

Discussion

AS-modeller som skapats i olika murina stammar valideras vanligtvis med tester av djurs känslomässiga tillstånd, motoriska funktioner och kognitiva förmågor för att underlätta jämförelse med mänskliga symtom31,32. Ett motoriskt underskott i AS-modeller är det mest konsekventa fyndet i laboratorier, följt av ett oförändrat emotionalitetstillstånd hos mutanter och svårigheter att bygga bon31,32,33

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna forskning stöddes av den tjeckiska vetenskapsakademin RVO 68378050, LM2018126 tjeckiska centret för fenogenomik som tillhandahålls av MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (uppgradering av det tjeckiska centrumet för fenogenomik: utveckling mot översättningsforskning av MEYS och ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (uppgradering av CCP-infrastruktur II av MEYS och ESI-fonderna) och OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (högre kvalitet och kapacitet för transgena modeller av MEYS och ERUF). Dessutom fick denna studie finansiering från den icke-statliga organisationen “Association of Gene Therapy (ASGENT)”, Tjeckien (https://asgent.org/) och LM2023036 tjeckiska centret för fenogenomik som tillhandahålls av Tjeckiens ministerium för utbildning, ungdom och idrott.

Materials

Cages, individually ventilated Techniplast
DigiGait Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level
Unit 110
Framingham, MA 01701, USA
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. 
FDA Nestlet squares Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm.
Mouse chow Altramion
Rotarod TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4
12489 Berlin, Germany
Equipment was tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm.
Tail Suspension Test Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles
FRANCE
Reference: BIO-TST5 Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided
Transpore medical tape Medical M, Ltd. P-AIRO1291 The tape used to attach an animal to the hook by its tail.
Viewer – Video Tracking System Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A
53111 Bonn, Germany
Equipment with software were tendered, no catalogue  number was provided, nor could be find on company's web site Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long,  9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. 

References

  1. Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
  2. Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
  3. Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
  4. Jolleff, N., Ryan, M. M. Communication development in Angelman’s syndrome. Archives of Disease in Childhood. 69 (1), 148-150 (1993).
  5. Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
  6. Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
  7. Huang, H. -. S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
  8. Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
  9. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  10. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  11. Carola, V., D’Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
  12. Yan, H. -. C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -. H., Gao, T. -. M. Behavioral animal models of depression. Neuroscience Bulletin. 26 (4), 327-337 (2010).
  13. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
  14. Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
  15. Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
  16. Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
  17. Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
  18. Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
  19. La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
  20. Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
  21. Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
  22. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  23. Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
  24. Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D’Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
  25. Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
  26. Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson’s disease and Huntington’s disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
  27. Hampton, T. G., et al. Gait disturbances in dystrophic hamsters. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 235354 (2011).
  28. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
  29. Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
  30. Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
  31. Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
  32. Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
  33. Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
  34. File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
  35. Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
  36. Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
  37. Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
  38. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
  39. Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
  40. Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
  41. Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
  42. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
  43. Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
  44. Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
  45. Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).

Play Video

Cite This Article
Kubik-Zahorodna, A., Prochazka, J., Sedlacek, R. Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model. J. Vis. Exp. (200), e65182, doi:10.3791/65182 (2023).

View Video