Dette manuskriptet presenterer et sett med svært reproduserbare atferdstester for å validere en Angelman syndrom musemodell.
Dette manuskriptet beskriver et batteri av atferdstester tilgjengelig for å karakterisere Angelman syndrom (AS)-lignende fenotyper i en etablert murinmodell av AS. Vi bruker læringsparadigmet rotarod, detaljert ganganalyse og reirbyggingstest for å oppdage og karakterisere motoriske funksjonsnedsettelser hos dyr. Vi tester dyrs emosjonalitet i det åpne feltet og forhøyede pluss labyrinttester, samt påvirkningen i haleopphengstesten. Når AS-mus testes i åpen felttest, bør resultatene tolkes med forsiktighet, siden motoriske dysfunksjoner påvirker museadferd i labyrinten og endrer aktivitetspoeng.
Reproduserbarheten og effektiviteten til de presenterte atferdstestene er allerede validert i flere uavhengige Uba3a-muselinjer med forskjellige knockout-varianter, og etablerer dette settet med tester som et utmerket valideringsverktøy i AS-forskning. Modeller med relevant konstruksjon og ansiktsvaliditet vil gi grunnlag for videre undersøkelser for å belyse sykdommens patofysiologi og gi utvikling av årsaksbehandling.
Angelman syndrom (AS) er en sjelden nevroutviklingssykdom. Den vanligste genetiske opprinnelsen til AS er en stor delesjon av 15q11-q13-regionen av det maternalt avledede kromosomet, som finnes hos nesten 74% av pasientene1. Sletting av denne regionen forårsaker tap av UBE3A, det viktigste årsaksgenet til AS som koder for en E3 ubiquitin ligase. Faderlig allel av UBE3A-genet i nevroner blir stilnet i en prosess kjent som imprinting. Som en konsekvens tillater fars imprinting av genet bare mors uttrykk i sentralnervesystemet (CNS)2. Derfor fører UBE3A-gendelesjon fra det maternelt avledede kromosomet til utvikling av AS-symptomer. Hos mennesker manifesterer AS seg rundt 6 måneder, med utviklingshemming som vedvarer gjennom alle utviklingsstadier og resulterer i alvorlige svekkende symptomer hos berørte individer 3,4. Kjernesymptomene på lidelsen inkluderer underskudd av fine og grovmotoriske ferdigheter, inkludert rykkete ataktisk gange, alvorlig talevansker og intellektuell funksjonshemming. Omtrent 80% av AS-pasientene lider også av søvnforstyrrelser og epilepsi. Til dags dato er den eneste tilgjengelige behandlingen symptomatiske legemidler, som reduserer epileptiske anfall og forbedrer søvnkvaliteten1. Derfor vil utvikling av robuste dyremodeller med reproduserbare atferdsfenotyper sammen med raffinert fenotypingsanalyse være avgjørende for å belyse de patofysiologiske mekanismene til lidelsen og oppdage effektive medisiner og behandlinger.
Kompleksiteten i den menneskelige lidelsen som påvirker CNS krever at modellorganismer har et sammenlignbart genom, fysiologi og oppførsel. Mus er populære som modellorganisme på grunn av deres korte reproduktive syklus, liten størrelse og relativt enkel DNA-modifisering. I 1984 foreslo Paul Willner tre grunnleggende sykdomsmodellvalideringskriterier: konstruksjonen, ansiktet og prediktiv validitet, som brukes til å bestemme modellens verdi5. Enkelt reflekterer begrepsvaliditet de biologiske mekanismene som er ansvarlige for lidelsesutviklingen, ansiktsvaliditet rekapitulerer symptomene, og prediktiv validitet beskriver modellresponsen på terapeutiske legemidler.
For å følge de ovennevnte prinsippene har vi valgt den vanligste genetiske etiologien, en stor delesjon av mors 15q11.2-13q locus inkludert UBE3A-genet, for å lage AS-modellmus. Vi brukte CRISPR / Cas9-teknikken for å slette en 76,225 bp lang region som spenner over hele UBE3A-genet, som omfatter både kodende og ikke-kodende elementer i genet, hos mus fra en C57BL / 6N bakgrunn6. Vi avlet deretter dyrene for å få UBE3A +/- heterozygote mus. For ansiktsvalidering av modellen brukte vi dyr fra kryss av UBE3A +/- hunner og villtypehanner for å få UBE3A +/- avkom (stamme kalt C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph og senere tildelt som UBE3A mGenedel/+) og kontrollkullkamerater. Vi testet deres fin- og grovmotoriske ferdigheter, følelsesmessighet og påvirkning for å rekapitulere kjerne AS-symptomer. I en tidligere artikkel har vi også evaluert dyrenes kognitive funksjoner, da pasienter også lider av utviklingshemming6. Vi fant imidlertid ingen kognitive funksjonsnedsettelser hos UBE3AmGenedel/+-mus, kanskje på grunn av dyrenes unge alder på testtidspunktet7. Senere undersøkelse av de eldre dyrene, rundt 18 uker gamle, avslørte et underskudd i atferdsmessig fleksibilitet under reverseringslæring i stedpreferanseparadigmet. Kompleksiteten til det anvendte utstyret for denne analysen krever imidlertid en egen metodologisk modul, og den er ikke inkludert her.
Atferdstestene som presenteres her tilhører de vanlige fenotypingsverktøyene i genetisk forskning, takket være deres høye prediktive verdi og tilstrekkelig konstruksjonsvaliditet 8,9,10. Vi brukte disse testene til å validere en musemodell av AS ved å rekapitulere kjernesymptomer på den menneskelige sykdommen på en reproduserbar, aldersuavhengig måte. Dyrets følelsesmessighet ble evaluert i forhøyede pluss labyrint og åpne felttester. Begge disse testene er basert på tilnærming-unngåelseskonflikten, hvor dyr utforsker et nytt miljø på jakt etter mat, ly eller parringsmuligheter samtidig som de unngår angstdempende rom11. I tillegg brukes åpen felttest til å teste musens bevegelsesaktivitet8. Halesuspensjonstesten er mye brukt i depresjonsforskning for å screene for nye antidepressiva eller depressiv-lignende fenotyper i museknockout-modeller12. Denne testen evaluerer fortvilelsen som dyr utvikler over tid i en uunngåelig situasjon. Motorisk læring og detaljerte gangkarakteristikker ble bestemt på henholdsvis rotarod og i DigiGait. Dyrs utholdenhet på den akselererende stangen karakteriserer dens balanse- og bevegelseskoordinasjonsferdigheter, mens detaljert analyse av musens trinnmønstre er en sensitiv evaluering av nevromuskulære funksjonsnedsettelser knyttet til mange nevrogenerative bevegelsesforstyrrelser13,14,15. Nestlet makuleringstest er en del av standardmetoden for å oppdage impulsiv oppførsel hos gnagere, og siden den bruker naturlig gnagerbyggingsadferd, indikerer den dyrets velvære16,17.
Størrelsen på eksperimentgruppene var et resultat av et kompromiss for å møte 3R-regelkravene og effektiv bruk av koloniavlsytelse. For å oppnå statistisk styrke hadde gruppene imidlertid ikke mindre enn 10 individer, på grunn av etablering av en tilstrekkelig mengde avlspar. Dessverre resulterte ikke avlsprestasjoner alltid i et tilstrekkelig antall dyr.
AS-modeller opprettet i forskjellige murinstammer blir ofte validert med tester av dyrs følelsesmessige tilstand, motorfunksjoner og kognitive evner for å lette sammenligning med menneskelige symptomer31,32. Et motorisk underskudd i AS-modeller er det mest konsistente funnet på tvers av laboratorier, etterfulgt av en uendret følelsesmessighetstilstand av mutanter og vanskeligheter med å bygge reir31,32,33<…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av det tsjekkiske vitenskapsakademiet RVO 68378050, LM2018126 tsjekkiske senteret for fenogenomikk levert av MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Oppgradering av det tsjekkiske senteret for fenogenomikk: utvikling mot oversettelsesforskning av MEYS og ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II av MEYS og ESIF), og OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (høyere kvalitet og kapasitet for transgene modeller av MEYS og ERDF). I tillegg mottok denne studien finansiering fra NGO “Association of Gene Therapy (ASGENT)”, Tsjekkia (https://asgent.org/) og LM2023036 tsjekkiske senteret for fenogenomikk levert av departementet for utdanning, ungdom og idrett i Tsjekkia.
Cages, individually ventilated | Techniplast | ||
DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. |
FDA Nestlet squares | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. | Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm. |
Mouse chow | Altramion | ||
Rotarod | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm. |
Tail Suspension Test | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE |
Reference: BIO-TST5 | Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided |
Transpore medical tape | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | The tape used to attach an animal to the hook by its tail. |
Viewer – Video Tracking System | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany |
Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. |