Eine einfache Technik zur Bestimmung der lokomotorischen Aktivität in Drosophila

Drosophila melanogaster ist ein hervorragender Modellorganismus für die Untersuchung zellulärer und molekularer Funktionen in neuronalen Krankheitsmodellen, die durch Genmodifikation¹, medikamentöse Behandlung² und Seneszenz³ entstanden sind. Die hohe Erhaltung biologischer Signalwege, physikalischer Eigenschaften und krankheitsassoziierter Homologgene zwischen Mensch und Drosophila macht die Fruchtfliege zu einem idealen Nachahmer von der molekularen bis zur Verhaltensebene⁴. In vielen Krankheitsmodellen ist die Verhaltensschwäche ein wichtiger Index, der ein hilfreiches Modell für verschiedene menschliche Neuropathien darstellt ^5,6. Drosophila wird heute verwendet, um mehrere menschliche Krankheiten, die neurologische Entwicklung und neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson und amyotrophe Lateralsklerose zu untersuchen ^7,8. Die Detektion der motorischen Fähigkeiten der Krankheitsmodelle ist entscheidend für das Verständnis des pathogenen Verlaufs und könnte eine phänotypische Korrelation zu den molekularen Mechanismen liefern, die dem Krankheitsprozess zugrunde liegen.

In jüngster Zeit wurden kommerziell erhältliche Software-Tools und kostengünstige Programme für Strategien zur Detektion des Bewegungsapparates von Drosophila entwickelt, wie z. B. Hochdurchsatztests in gruppierten Fliegen^9,10 und Messungen der Fortbewegung in Echtzeit^11,12. Ein solcher konventioneller Ansatz ist die schnelle interaktive negative Geotaxis (RING), auch Kletterassay genannt, der mehrere Kanäle umfasst, die es ermöglichen, eine große Fliegenpopulation mit gleichem Geschlecht und Alter einzudämmen, wodurch die Variation reduziert wird, während die Daten gesammelt werden ^9,13. Ein weiteres Vortestverfahren zur Analyse des Bewegungsverhaltens ist der TriKinetics Drosophila Activity Monitor (DAM), eine Vorrichtung, die mehrere Strahlen verwendet, um die Bewegung der Fliegenaktivität innerhalb eines dünnen Glasröhrchens¹⁴ zu erfassen. Die Vorrichtung zeichnet kontinuierlich die Position auf, die eine automatisierte Fortbewegung darstellt, indem die Strahlkreuzungen berechnet werden, um die Aktivität und den circadianen Rhythmus von Fliegen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen¹⁵. Obwohl diese Methoden bei der Analyse von Verhaltensfehlern bei Fruchtfliegen weit verbreitet sind, um Veränderungen in der Verhaltensfortbewegung zu bestimmen, erfordern sie immer spezielle Testgeräte oder komplexe Analyseprozesse und schränken ihre Anwendung in einigen Modellen mit einem begrenzten, einfachen Gerät ein. Gruppenbasierte Strategien zur Tierverfolgung zum Testen der adulten Drosophila, wie z. B. FlyGrAM¹¹ und der Drosophila Island Assay¹⁰, implementieren soziale Rekrutierung und individuelles Tracking in einem vordefinierten Bereich. Nichtsdestotrotz können sich soziale individuelle Einschränkungen in benachteiligten Gebieten negativ auf die Identifizierung in den Bildern auswirken, verursacht durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen. Auch wenn einige materialbasierte Open-Source-Methoden wie TRex¹⁶, MARGO 12 und FlyPi¹⁷ einen Notfall haben, können sie die Fliegen mit flexiblem Einsatz in Verhaltenstests schnell verfolgen. Diese Testansätze sind mit aufwendigen Versuchsapparaturen, speziellen Softwareanforderungen oder professionellen Computersprachen verbunden. Bei Larven sind die Messung der Gesamtstrecke, die über die Anzahl der Gitterbegrenzungslinien pro Zeiteinheit¹⁸ zurückgelegt wird, oder die grobe Zählung der Körperwandkontraktionen für Individuen¹⁹ die vorherrschenden Methoden zur Beurteilung ihrer Bewegungsfähigkeit. Aufgrund der mangelnden Präzision von Geräten oder Vorrichtungen und Analysemethoden kann es vorkommen, dass einige Verhaltensbewegungen von Larven nicht entdeckt werden, was es schwierig macht, Verhaltensbewegungen, insbesondere feine Bewegungen, genau zu beurteilen¹⁵.

Die hier entwickelte Methode nutzt die AnimalTracker-Programmierschnittstelle (API), die mit dem Fidschi-Bildverarbeitungsprogramm (ImageJ) kompatibel ist, um die Bewegungsaktivität sowohl von adulten als auch von Larvenfliegen systematisch zu bewerten, indem ihr Tracking-Verhalten aus hochauflösenden (HD) Videos analysiert wird. Fiji ist eine Open-Source-Software-ImageJ-Distribution, die robuste Softwarebibliotheken mit zahlreichen Skriptsprachen kombinieren kann, was zu einem schnellen Prototyping von Bildverarbeitungsalgorithmen führt, was sie bei Biologen wegen ihrer Bildanalysefunktionen beliebt macht²⁰. Im aktuellen Ansatz wird die Integration von Fidschi in die AnimalTracker-API genutzt, um einen einzigartigen Drosophila-Verhaltensassay mit personalisierter Algorithmus-Einfügung zu entwickeln, und bietet einen nützlichen Schritt für detaillierte Dokumentationen und Tutorials, um robuste analytische Fähigkeiten des Bewegungsverhaltens zu unterstützen (Abbildung 1). Um die Komplikation der objektiven Identifizierung in den Bildern zu umgehen, die durch die Kollision oder Überlappung von Fliegen verursacht wird, ist jede Arena darauf beschränkt, nur eine Fliege zu beherbergen. Nach der Bewertung der Tracking-Präzision des Ansatzes wurde er implementiert, um die Bewegungsbewegungen von Drosophila zu verfolgen und zu quantifizieren, die mit dem toxischen Medikament Rotenon verabreicht wurden, das im Allgemeinen für Tiermodelle der Parkinson-Krankheit verwendet wird, und schließlich eine Beeinträchtigung der Fortbewegung in der medikamentösen Behandlung entdeckte²¹. Diese Methodik, die Open-Source- und freie Software verwendet, erfordert keine kostspieligen Instrumente und kann die Verhaltensbewegung von Drosophila präzise und reproduzierbar analysieren.