توضيح استقلاب 2،4-ثنائي بروموفينول في النباتات
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لتحديد مستقلبات 2،4-ثنائي برومو فينول في النباتات.
Abstract
يمكن أن تتعرض المحاصيل على نطاق واسع للملوثات العضوية ، لأن التربة هي بالوعة رئيسية للملوثات التي يتم التخلص منها في البيئة. وهذا يخلق تعرضا بشريا محتملا من خلال استهلاك الأغذية المتراكمة الملوثات. إن توضيح امتصاص واستقلاب الزينوبيوتيك في المحاصيل أمر ضروري لتقييم مخاطر التعرض الغذائي لدى البشر. ومع ذلك ، بالنسبة لمثل هذه التجارب ، يتطلب استخدام النباتات السليمة تجارب طويلة الأجل وبروتوكولات معقدة لإعداد العينات يمكن أن تتأثر بعوامل مختلفة. قد توفر مزارع الكالس النباتية جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي عالي الدقة (HRMS) حلا لتحديد دقيق وموفر للوقت لمستقلبات الكائنات الحية في النباتات ، حيث يمكن أن يتجنب التداخل من البيئة الدقيقة الميكروبية أو الفطرية ، وتقصير مدة العلاج ، وتبسيط تأثير المصفوفة للنباتات السليمة. تم اختيار 2،4-ثنائي برومو فينول ، وهو مثبط نموذجي للهب واضطراب الغدد الصماء ، كمادة نموذجية بسبب انتشاره على نطاق واسع في التربة وإمكانية امتصاصه من قبل النباتات. هنا ، تم إنشاء الكالس النباتي من بذور التعقيم وتعريضه لوسط استزراع معقم يحتوي على 2،4-ثنائي بروموفينول. أظهرت النتائج أنه تم تحديد ثمانية مستقلبات من 2،4-ثنائي بروموفينول في أنسجة الكالس النباتية بعد 120 ساعة من الحضانة. يشير هذا إلى أن 2،4-ثنائي بروموفينول تم استقلابه بسرعة في أنسجة الكالس النباتية. وبالتالي ، فإن منصة زراعة الكالس النباتية هي طريقة فعالة لتقييم امتصاص واستقلاب xenobiotics في النباتات.
Introduction
تم التخلص من عدد متزايد من الملوثات العضوية في البيئة بسبب الأنشطة البشريةالمنشأ 1,2 ، وتعتبر التربة بالوعة رئيسية لهذه الملوثات 3,4. يمكن أن تمتص النباتات الملوثات الموجودة في التربة ويحتمل أن تنتقل إلى كائنات ذات مستوى غذائي أعلى على طول سلاسل الغذاء ، عن طريق الدخول مباشرة إلى جسم الإنسان من خلال استهلاك المحاصيل ، مما يؤدي إلى التعرض غير المقصود 5,6. تستخدم النباتات مسارات مختلفة لاستقلاب xenobiotics لإزالة السموم7 ؛ من المهم توضيح عملية التمثيل الغذائي للأجانب ، لأنه يتحكم في المصير الفعلي للملوثات في النباتات. نظرا لأن المستقلبات يمكن أن تفرز عن طريق الأوراق (إلى الغلاف الجوي) أو الجذور ، فإن تحديد المستقلبات في المراحل المبكرة جدا من التعرض يوفر إمكانية اختبار عدد كبير من المستقلبات8. ومع ذلك ، تتطلب الدراسات التي تستخدم النباتات السليمة تجارب طويلة الأجل وبروتوكولات معقدة لإعداد العينات يمكن أن تتأثر بعوامل مختلفة.
لذلك ، تعد ثقافات الكالس النباتية بديلا جيدا لدراسة استقلاب الكائنات الحية في النبات ، حيث يمكنها تقصير وقت العلاج بشكل كبير. تستبعد هذه الثقافات التداخل الميكروبي والتحلل الكيميائي الضوئي ، وتبسط تأثير المصفوفة للنباتات السليمة ، وتوحد ظروف الزراعة ، وتتطلب جهدا تجريبيا أقل. تم تطبيق مزارع الكالس النباتية بنجاح كنهج بديل في الدراسات الأيضية للتريكلوسان9 ونونيل فينول10 وتيبوكونازول8. أظهرت هذه الدراسات أن أنماط التمثيل الغذائي في مزارع الكالس كانت مماثلة لتلك الموجودة في النباتات السليمة. تقترح هذه الدراسة طريقة لتحديد فعال ودقيق لمستقلبات xenobiotics في النباتات التي لا تحتوي على بروتوكولات معقدة وتستغرق وقتا طويلا. هنا ، نستخدم ثقافات الكالس النباتية مع قياس الطيف الكتلي عالي الدقة لتحليل المستقلبات ذات الإشارات منخفضة الكثافة11,12.
وتحقيقا لهذه الغاية، تعرضت معلقات الكالس للجزرة (Daucus carota var. sativus) إلى 100 ميكروغرام/لتر من 2،4-ثنائي برومو فينول لمدة 120 ساعة في شاكر عند 130 دورة في الدقيقة و 26 درجة مئوية. تم اختيار 2،4-ثنائي برومو فينول بسبب نشاطه الغدد الصماءالتخريبي 13 وحدوثه على نطاق واسع في التربة14. تم استخراج المستقلبات وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة عالي الدقة. يمكن للبروتوكول المقترح هنا التحقيق في التمثيل الغذائي في النبات لأنواع أخرى من المركبات العضوية التي يمكن أن تتأين.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطوير هذا البروتوكول لتحديد التحول الحيوي للأجانب في النباتات بكفاءة. الخطوة الحاسمة لهذا البروتوكول هي ثقافة الكالس النباتي. الجزء الأصعب هو تمايز وصيانة الكالس النباتي ، لأن الكالس النباتي يصاب بسهولة ويتطور إلى أنسجة نباتية. لذلك ، من المهم التأكد من تعقيم جميع المعدات المستخدمة ، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21976160) ومشروع أبحاث تطبيق تكنولوجيا الرفاهية العامة بمقاطعة تشجيانغ (LGF21B070006).
Materials
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | WAKO | 1 mg/L | |
| 20% H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10011218-500ML | |
| 4-n-NP, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| 4-n-NP-d4 | Pointe-Claire | ||
| 6-benzylaminopurine | WAKO | 0.5 mg/L | |
| 75% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 1269101-500ML | |
| 7890A-5975 gas chromatography | Agilent | ||
| ACQULTY ultra-performance liquid chromatography | Waters | ||
| Amber glass vials | Waters | ||
| Artificial climate incubator | Ningbo DongNan Lab Equipment Co.,LTD | RDN-1000A-4 | |
| Autoclaves | STIK | MJ-Series | |
| C18 column | ACQUITY UPLC BEH | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | ||
| DB-5MS capillary column | Agilent | ||
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 40071190-4L | |
| Freeze dryer | SCIENTZ | ||
| High-throughput tissue grinder | SCIENTZ | ||
| Methanol | Sigma-Aldrich | ||
| MicrOTOF-QII mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| Milli-Q system | Millipore | MS1922801-4L | |
| Murashige & Skoog medium | HOPEBIO | HB8469-7 | |
| N-hexane | Sigma-Aldrich | H109658-4L | |
| Nitrogen blowing instrument | AOSHENG | MD200-2 | |
| NP isomers, >99% | Dr. Ehrenstorfer GmbH | ||
| Oasis HLB cartridges | Waters | 60 mg/3 mL | |
| Research plus | Eppendorf | 100-1000 µL | |
| Seeds of Little Finger carrot (Daucus carota var. sativus) | Shouguang Seed Industry Co., Ltd | ||
| Shaking Incubators | Shanghai bluepard instruments Co.,ltd. | THZ-98AB | |
| Solid phase extractor | AUTO SCIENCE | ||
| Ultrasound machine | ZKI | UC-6 | |
| UV-sterilized ultra-clean workbench | AIRTECH |
References
- Chakraborty, P., et al. Baseline investigation on plasticizers, bisphenol A, polycyclic aromatic hydrocarbons and heavy metals in the surface soil of the informal electronic waste recycling workshops and nearby open dumpsites in Indian metropolitan cities. Environmental Pollution. 248, 1036-1045 (2019).
- Abril, C., Santos, J. L., Martin, J., Aparicio, I., Alonso, E. Occurrence, fate and environmental risk of anionic surfactants, bisphenol A, perfluorinated compounds and personal care products in sludge stabilization treatments. Science of the Total Environment. 711, 135048 (2020).
- Xu, Y. W., et al. Determination and occurrence of bisphenol A and thirteen structural analogs in soil. Chemosphere. 277, 130232 (2021).
- Cai, Q. Y., et al. Occurrence of nonylphenol and nonylphenol monoethoxylate in soil and vegetables from vegetable farms in the Pearl River Delta, South China. Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 63 (1), 22-28 (2012).
- Wang, S. Y., et al. et al Migration and health risks of nonylphenol and bisphenol a in soil-winter wheat systems with long-term reclaimed water irrigation. Ecotoxicology and Environmental Safety. 158, 28-36 (2018).
- Gunther, K., Racker, T., Bohme, R. An isomer-specific approach to endocrine-disrupting nonylphenol in infant food. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (6), 1247-1254 (2017).
- Van Eerd, L. L., Hoagland, R. E., Zablotowicz, R. M., Hall, J. C. Pesticide metabolism in plants and microorganisms. Weed Science. 51 (4), 472-495 (2003).
- Hillebrands, L., Lamshoeft, M., Lagojda, A., Stork, A., Kayser, O. Evaluation of callus cultures to elucidate the metabolism of tebuconazole, flurtamone, fenhexamid, and metalaxyl-M in Brassica napus L., Glycine max (L.) Merr., Zea mays L., and Triticum aestivum L. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (48), 14123-14134 (2020).
- Macherius, A., et al. Metabolization of the bacteriostatic agent triclosan in edible plants and its consequences for plant uptake assessment. Environmental Science & Technology. 46 (19), 10797-10804 (2012).
- Sun, J. Q., et al. Uptake and metabolism of nonylphenol in plants: Isomer selectivity involved with direct conjugation. Environmental Pollution. 270, 116064 (2021).
- Schymanski, E. L., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental Science & Technology. 48 (4), 2097-2098 (2014).
- Moschet, C., Anumol, T., Lew, B. M., Bennett, D. H., Young, T. M. Household dust as a repository of chemical accumulation: new insights from a comprehensive high-resolution mass spectrometric study. Environmental Science & Technology. 52 (5), 2878-2887 (2018).
- Ren, Z., et al. Hydroxylated PBDEs and brominated phenolic compounds in particulate matters emitted during recycling of waste printed circuit boards in a typical e-waste workshop of South China. Environmental Pollution. 177, 71-77 (2013).
- de Wit, C. A. An overview of brominated flame retardants in the environment. Chemosphere. 46 (5), 583-624 (2002).
- Sun, J. Q., Chen, Q., Qian, Z. X., Zheng, Y., Yu, S. A., Zhang, A. P. Plant Uptake and Metabolism of e,4-Dibromophenol in Carrot: In Vitro Enzymatic Direct Conjugation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (17), 4328-4335 (2018).
- Chibwe, L., Titaley, I. A., Hoh, E., Simonich, S. L. M. Integrated framework for identifying toxic transformation products in complex environmental mixtures. Environmental Science & Technology Letters. 4 (2), 32-43 (2017).
- Hollender, J., Schymanski, E. L., Singer, H. P., Ferguson, P. L. Nontarget screening with high resolution mass spectrometry in the environment: ready to go. Environmental Science & Technology. 51 (20), 11505-11512 (2017).
- Nafisi, M., Fimognari, L., Sakuragi, Y. Interplays between the cell wall and phytohormones in interaction between plants and necrotrophic pathogens. Phytochemistry. 112, 63-71 (2015).
- Zhang, Q., et al. Multiple metabolic pathways of 2,4,6-tribromophenol in rice plants. Environmental Science & Technology. 53 (13), 7473-7482 (2019).
- Hou, X., et al. Glycosylation of tetrabromobisphenol A in pumpkin. Environmental Science & Technology. 53 (15), 8805-8812 (2019).
