使用核内流式细胞术定量分离小鼠脑小胶质细胞中的整体组蛋白翻译后修饰

所有动物护理协议均由不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会根据加拿大动物护理委员会指南批准。 1. 用于小胶质细胞分离的脑消化 图 1：协议的简单流程图。 首先用HBSS经心灌注小鼠，然后解剖大脑。然后，大脑通过化学消化和机械破坏解离，形成单细胞匀浆。通过不连续的密度梯度收集免疫富集部分，然后对细胞进行 P2RY12 染色。染色的细胞 1） 通过荧光活化细胞分选 （FACS） 进行分选以进行 RNA 分析或下游蛋白质分析和/或 2） 固定、透化和染色以进行核内蛋白。通过流式细胞术确定的目标通道中的中值荧光强度来量化蛋白质水平。蓝色的方框是协议步骤 1） 小胶质细胞分离的脑消化的一部分。红色框是协议步骤 2） 用于蛋白质表达分析的核内流动染色的一部分。用 BioRender.com 创建。 请点击这里查看此图的较大版本. 试剂的制备注意：如果计划提取以收集 RNA 和细胞进行 HPTM 分析，请参阅第 1.7.1 节，了解包括转录和翻译抑制剂的修饰。然而，如果只是评估蛋白质信号，则不需要这样做，因为细胞在冰上保持静止时基本上是静止的。荧光活化细胞分选 （FACS） 缓冲液（每个样品 20 mL）：将牛血清白蛋白 （BSA） 溶解在 1x Hanks 平衡盐溶液 （HBSS） 中以制备 2% BSA 溶液。将EDTA溶解至2%BSA溶液中的终浓度为1mM。使用0.2μm过滤器过滤灭菌，并在使用前在4°C下储存长达1周。 消解缓冲液（每个样品 1 mL）：在 HBSS 中复溶一小瓶木瓜蛋白酶，在含有 0.5 mM EDTA 的 1 mM L-半胱氨酸中达到终浓度为 20 U/mL。在37°C下活化至少10分钟或直到准备好消化组织。使用前，将 DNase I 添加到活化的木瓜蛋白酶溶液中，最终浓度为 200 U/mL。在实验当天准备，不要储存。 等渗密度梯度溶液（每个样品 5.5 mL）：将 10x HBSS 添加到冷密度梯度介质中，最终浓度为 1x HBSS，最终密度为 1.117 g/mL。使用前涡旋混合至少 30 秒。放在冰上直至使用。 37% 密度梯度溶液（每个样品 4 mL）：向 1x HBSS 中加入等渗密度梯度，使终浓度为 37%，终密度为 1.043 g/mL。每 mL 密度梯度为 37% 时加入 20 μL 酚红，制成粉红色溶液，用于分层过程中的可视化。使用前涡旋至少 30 秒。放在冰上直至使用。 70% 密度梯度溶液（每个样品 2 mL）：将等渗密度梯度加入 1x HBSS 中，使终浓度为 70%，终密度为 1.082 g/mL。每 mL 密度为 70% 的培养基加入 5 μL 台盼蓝，制成蓝色溶液，用于分层过程中的可视化。使用前涡旋至少 30 秒。放在冰上直至使用。 灌注和脑部夹层注意：灌注方案类似于 Posel 等人，其特点是小鼠开胸术、经心灌注和脑切除术的视频描述21.在这里，我们使用成年C57BL / 6J雄性和雌性小鼠（10-15周龄，20-30g），但该协议可用于对任何小鼠进行开胸术。在进行实验之前，所有动物程序都必须得到机构伦理委员会的批准。小鼠麻醉：用4%异氟醚在100%氧气中麻醉小鼠，直到超过手术麻醉平面，这可以通过捏脚趾或用力捏住小鼠脚时缺乏反射来确认。将鼠标放在背上，将其四只爪子牢牢地固定在倾斜放置在塑料托盘中的手术解剖板中，确保鼻子固定在异氟烷鼻锥中。转移后，确保动物仍然超过麻醉的手术平面，然后再进行。 小鼠胸腔：用镊子抓住并提起腹部皮肤，在皮肤和腹壁上做一个浅切口，露出木质，而不会损坏降主动脉或任何下层器官。 用镊子夹住木膈肌，在胸腔下方做横向切口，露出横膈膜和肝脏。用细剪刀沿着肋骨的长度小心地浅切开横膈膜，用组织剪刀穿过胸腔，并将胸骨钉在小鼠头部附近的手术台上，以暴露心脏和肺部进行心肌灌注。 经心灌注：准备蠕动灌注泵，将一根 26.5G 针头连接到管子的一端。通过将管子的一端插入冷的 1x HBSS 小瓶中并打开泵以用 1x HBSS 完全填充管子来为该过程灌注管路。 用钝镊子握住心脏的同时，将带有灌注管的 26.5G 针尖插入心脏的左心室，并在右心房做一个小切口。打开灌注泵，以至少15-20mL冷1x HBSS以~2-4mL / min的速率小心地灌注小鼠。注意：当肝脏开始清除血液并变得与心脏颜色相同时，通常表明完全灌注。 脑切除术：使用组织解剖剪刀将小鼠斩首，并在从颈部到鼻子的头皮上做一个中线切口。将皮瓣向两侧剥离，露出颅骨，并用解剖剪刀去除颅骨尾端多余的组织和骨骼。 小心地将剪刀的一把刀片滑入颅骨下方的枕骨大孔中，锋利的一面朝向骨头，然后小心地将中线切向鼻子。使用解剖剪刀在颅底和鼻子附近进行横向切割。使用细镊子，从中线到外部对头骨进行生理，以裂开头骨碎片并暴露大脑。用刮刀轻轻抬起大脑，放在解剖印迹纸上。 脑解剖：将大脑放在一张用 1x HBSS 润湿的解剖印迹纸上，放在装满冰的封闭培养皿上。取出小脑，用干净的剃须刀片将脑半球一分为二。 从每个半球切除脑干、纹状体和白质，同时保持海马体和覆盖皮层完整。将含有分离皮层和海马组织的半球转移到装有 5 mL 冷 1x HBSS 的 15 mL 管中并保持在冰上。注意：重要的是尽快进行解剖，以便组织保持低温，在斩首和最终将解剖组织放入冰上的 1x HBSS 中不超过 2 分钟。如果从多只动物中分离出小胶质细胞，则可以将大脑储存在1x HBSS中的冰上~1小时，然后再处理整个动物队列进行消化等。 大脑消化和均质化机械和化学解离：将每只小鼠的脑组织和 1 mL 消化缓冲液放入冰上的单个培养皿中。使用干净的手术刀刀片，将大脑彻底切成小块（<1毫米）。 从塑料移液管上切下尖端，小心地将每个切碎的大脑转移到冰上的24孔板内的单独孔中。用透明柔性薄膜覆盖板，并在冰上孵育30分钟。注意：如果切碎得当，脑组织类似于切碎的大蒜。 Dounce 均质化：将消化的脑溶液从每个孔转移到冰上的单个 7 mL 玻璃 Dounce 均质器中，每个均充满 5 mL 冷 FACS 缓冲液。用松散的杵（A）轻轻蘸每个大脑，大约30-40次，直到获得单细胞悬浮液。用 A 杵掺搓后，用紧杵 （B） 轻轻掰搓 3-4 次，以确保单细胞悬浮液。注意： 不要将研杵向下推超过 3/4，以免压碎均质器底部的组织。最终的解决方案应该是不透明的和乳白色的。注意：如果在一次实验中消化多个大脑，则定时将大脑消化转移到FACS缓冲液中，以便每个样品仅在消化缓冲液中停留30分钟。过度消化会导致表面蛋白的裂解，从而减少下游抗体的结合和信号。 获得免疫富集片段建立密度梯度：将来自每个脑的匀浆转移到单独的 15 mL 聚丙烯管中，并加入 2.125 mL 等渗密度梯度，并加入 8.5 mL，每个管都加入 FACS 缓冲液，以获得 25% 密度梯度的最终浓度。轻轻地将15ml管倒置20倍以充分混合。 使用窄刻度移液管，将 4 mL 37% 密度梯度轻轻覆盖到每个试管上，非常小心地建立干净的层。切换移液器并轻轻覆盖2mL的70%密度梯度（图2A）。转移到冷却至4°C的离心机中，并以500× g 旋转20分钟，制动斜坡设置为零。 收集免疫富集片段：使用干净的移液管，使用干净的移液管从15 mL管中的体积顶部轻轻吸出髓鞘，然后弃去。使用移液管小心地将密度梯度的顶部片段收集到干净的 15 mL 聚丙烯管中。 小心地将免疫富集片段（在70%和37%密度梯度层相遇的地方上方1.5mL和下方1.5mL）收集到新的15mL聚丙烯管中（图2B）。向免疫富集样品中加入 10 mL FACS 缓冲液以稀释密度梯度培养基，然后轻轻倒置试管 20 倍以充分混合。注意：由于细胞往往会粘在试管的侧面，因此在收集液体时，通过沿着试管侧面缓慢绕移液器，确保在收集步骤中收集样品中的所有细胞。 通过在4°C离心机中以500× g 离心15mL管10分钟，并将下坡斜坡制动器设置为零，沉淀免疫富集样品中的细胞。旋转结束后，立即小心地取出上清液，在15mL管中留下约300μL液体，注意不要干扰沉淀（可能不可见）。 将上清液收集在另一个 15 mL 管中，以确保细胞在离心中沉淀（一旦用重悬沉淀的细胞计数进行验证，就丢弃该部分）。使用 P1000 移液管将细胞沉淀重悬于 300 μL 体积后，用血细胞计数器对细胞进行计数以估计总细胞产量。 图2：通过不连续密度梯度获得免疫富集片段。 （A） 将脑匀浆制成 25% 密度的培养基，通过酚红覆盖 4 mL 密度 37% 的中等颜色粉红色和 2 mL 通过台盼蓝的 70% 密度中等颜色蓝色。（B） 离心后，馏分已分离。小胶质细胞位于密度为 37% 和 70% 的介质碎片的界面上。髓鞘片段位于 15 mL 试管的顶部，将被丢弃。收集顶部片段作为备份，以防旋转失败，并且没有细胞被回收。如果发生这种情况，可以使用此分数重复梯度。免疫富集部分被收集到下游。含有任何红细胞的底部部分保留在试管中并被丢弃。（C） 描绘完整图层的示例图。用 BioRender.com 创建。 请点击这里查看此图的较大版本. 细胞外抗体染色封闭：将细胞转移到冰上的圆底 96 孔板上，并以 500 x g 离心，制动器使细胞沉淀。通过轻弹板以处理上清液，快速除去水槽中的上清液，使细胞沉淀完好无损地留在孔底。 使用 P200 移液管（终浓度 10 μg/mL，稀释因子 1：50）将细胞重悬于含有抗小鼠 CD16/32 FC 受体封闭试剂的 50 μL FACS 缓冲液中，以防止抗体与单核细胞或其他 FcR 携带细胞的非特异性结合。在冰上孵育10分钟。 抗体染色：制备适当体积的含有 P2RY12- 别藻蓝蛋白（APC;稀释因子 1：50，浓度 4 μg/mL，终孔浓度为 1：100，浓度 2 μg/mL）和紫色 525 活死染料（稀释因子 1：50，终孔浓度为 1：100）。将 50 μL 染色预混液加入细胞悬液（在第 1.5.1 节中封闭后获得）中，并将板在冰上黑暗孵育 30 分钟。注意：对于该方案，我们提出用P2RY12对细胞进行染色。首先，P2RY12是小胶质细胞的稳态标志物，在某些疾病情况下可以下调。例如，5XFAD阿尔茨海默氏症模型小鼠的P2RY12水平下调，这可能使它们难以识别22。可用于分离的替代染料包括 Tmem119、Cd11b 和 CD4523。其次，可以调整偶联荧光染料APC以适应所需的抗体组。然而，选择明亮的荧光染料，如APC或PE，将有助于确保阳性和阴性群体易于区分24。 染色后，将 200 μL FACS 缓冲液直接加入每个孔中以洗涤细胞。在4°C下以500× g 旋转以通过轻弹除去上清液。用P200移液管将细胞重悬于200μLFACS缓冲液中，在4°C下以500× g 旋转，然后轻弹板以从孔中除去缓冲液。 制备流量对照品：在染色之前，在步骤1.5.1中封闭后，从每个样品中分离出必要体积的细胞，以获得所需的流量对照品。注意：每次实验都需要流量控制来建立浇口。流量控制可以取自其他动物或每个实验孔的一小部分。分裂细胞时，确保为每个对照分配足够的细胞，因为每个对照需要 10,000-30,000 个细胞才能以高置信度建立门。有三种相关的流量对照：无染色、活死和 P2RY12 同型对照。对于无染色对照，请勿添加任何抗体。在 P2RY12 同种型对照中，用活性染料 （1：100） 和与 APC 偶联的同型对照抗体 （1：100） 处理细胞。 为了制备活死对照，将细胞分装到单独的孔中，并将一半的细胞体积移入 500 μL 管中。将 500 μL 试管放入 -80 °C 冰箱中 5 分钟，然后放入 37 °C 培养箱中 5 分钟以杀死细胞。将死细胞的等分试样放回活死对照孔中，并用紫罗兰色525（稀释因子1：100）上的胺结合活性染料染色以标记死细胞。注意：该方案是为平板染色而编写的，采用轻弹法去除上清液。然而，这需要在离心完成后立即去除上清液，并且需要以足够的力进行轻弹，以便在不干扰沉淀的情况下快速去除上清液。或者，可以使用1.5mL RNAse / DNase游离管进行染色，并进行以下修改：将细胞转移到1.5mL微量离心管中，并在4°C下以800× g 沉淀5分钟。 用移液器吸出上清液。提示：为了提高速度，带有 P200 吸头的 5 mL 移液器可以快速准确地吸出上清液。吸气时，检查颗粒。如果沉淀不可见，请留下 50 μL 上清液并相应地调整计算。洗脱抗体时，添加额外的 FACS 以增加抗体的稀释度（1000 μL 而不是 200 μL），以解决上清液去除不完全的原因。根据流式细胞仪的不同，使用 1.5 mL 试管进行分选，从而减少所需的耗材量。 小胶质细胞的FACS分选制备：用 P200 移液管将每个孔重悬于 200 μL FACS 缓冲液中，然后转移到标记的流式分选管中，并将 FACS 缓冲液加入总计 500 μL，浓度约为 5 x 10 5 个事件/mL。在黑暗中储存在冰上，直到分析。通过加入 100 μL FACS 缓冲液作为 1.5 mL 无 RNAse 试管中细胞的缓冲垫来制备分选后管。 流式细胞仪设置：在设置有 100 μm 喷嘴的流式细胞仪上对细胞进行分选。使用 18-20 psi 对细胞进行分类。 门控：在流式细胞仪上，使用侧向散射 （SSC） 面积与前向散射 （FSC） 高度对细胞大小进行门，使用无染色控制来帮助区分碎片，将 SSC-A 放在对数轴上以可视化细胞群并密切门以选择细胞（门 S1; 图3）。要去除任何双峰，请绘制 FSC-H 与 FSC-W 的图谱，并在细胞群周围紧密栅门，去除任何碎片和双峰（门 S2）。使用 P2RY12 同种型对照，检查 APC 通道中的细胞并设置自发荧光门以确定 P2RY12+ 细胞。使用无染色和活死对照，将紫光 525 nm 上不发荧光的细胞作为活细胞进行门。 排序：绘制紫色 525 nm 与 APC 的关系，并确定 P2RY12+ 并通过 FMO （MG） 生存的种群。将这些细胞分选到标记的后分选管中（图3）。最终排序百分比约为总事件的 50%，其中大部分事件总损失是在门 S1 中清除的碎片（~70% 的事件是细胞; 表1）。 RNA分离和分析转录和翻译抑制剂：如果计划提取 RNA，为了消除分离相关转录组特征的风险，请在缓冲步骤中加入翻译和转录抑制剂。制备Marsh等人描述的抑制剂混合物，包括放线菌素D，茴香霉素和雷公藤内酯25。抑制剂制备：复溶抑制剂储备并按如下方式储存：将放线菌素D在二甲基亚砜（DMSO）中的复溶至5mg/mL，并在-20°C下储存。 将雷公藤甲内酯在DMSO中复溶至10mM，并储存在-20°C，避光保存。将茴香霉素在DMSO中的复溶至10mg / mL，并储存在4°C，避光保存。复溶后储存所有抑制剂储备液不超过 1 个月。 缓冲液修饰：在方案中的四种不同缓冲液中添加抑制剂，如下所示：进行经心灌注时，用放线菌素D（5μg/ mL，1：1000从库存中）和雷公藤内酯（10μM，1：1000从库存中）制备HBSS。灌注后，将含有放线菌素D（5μg/mL，1：1000,1：1000）雷公藤内酯（10μM，1：1000）和茴香霉素（27.1μg/mL，1：368.5）的HBSS中的大脑运送到实验室。用放线菌素D（5μg/mL，1：1000,1：1000，雷公藤素）和茴香霉素（27.1μg/mL，1：368.5）制备FACS缓冲液。用放线菌素D（5μg/mL，1：1000，原料1：1000）、雷公藤内酯（10μM，1：1000）和茴香霉素（27.1μg/mL，1：368.5原料）制备消化缓冲液。制备分选后洗涤缓冲液，HBSS含有放线菌素D（5μg/mL，1：1000,1：1000,1：1000）和茴香霉素（27.1μg/mL，1：368.5）。注意：添加抑制剂时，请确保在使用前立即添加它们，并在使用时保护任何准备好的缓冲液免受光线照射。避免储备溶液冻融。 分选后洗涤：由于细胞已在 FACS 缓冲液中分选到 1.5 mL 无 RNase 试管中，这会干扰 RNA 分离，因此有必要洗涤细胞。在4°C下以1000× g 旋转细胞5分钟并除去上清液，留下约50μL液体。 加入 200 μL 含有放线菌素 D（5 μg/mL，1：1000 原料）、雷公藤内酯（10 μM，1：1000 原料）和茴香霉素（27.1 μg/mL，1：368.5 原料）的 1x HBSS，并充分混合。重复旋转并除去上清液，留下 50 μL 液体（洗涤 1）。加入 200 μL 分选后洗涤缓冲液，充分混合并重复旋转并除去上清液，留下 25 μL 液体（洗涤 2）。 RNA 提取：对于从小胶质细胞中分离 RNA，请使用低起始量 RNA 分离试剂盒，以获得高且一致的 RNA 产量和 RIN 评分高于 9（产品推荐见下文和 材料表 ）。向细胞沉淀中加入推荐试剂盒中的350μL裂解缓冲液+β-巯基乙醇（1：100）并充分混合。注意：如有必要，此时可以暂停协议。样品可以储存在-80°C的裂解缓冲液中，直到RNA提取。如果在储存后提取 RNA，请在冰上解冻裂解物，然后按照试剂盒特定的说明进行分离。 将裂解物转移到基于柱的细胞粉碎机中（有关产品建议 ，请参阅材料表 ），并在4°C下以最大速度离心2分钟。在至少 14 μL 无 RNase 的水中洗脱，并酌情测定浓度。在此之后，RNA可用于任何下游应用。 图 3：流排序的门控策略。 事件针对 SSC-A 与 FSC-H （S1） 上的单元大小进行门控。然后，将细胞门控为 FSC-H 与 FSC-W （S2） 上的单线态。使用 P2RY12 同种型对照，将单线态细胞分选为活细胞（如果在 Comp-FL8-A：：405-526-52）（紫色 525 活死染色剂）上呈阴性，如果在 Comp-FL32-A：：640-671_30 （P2RY12-APC） 上呈阳性，则分选为 P2RY12+。细胞被标记为 MG，如果同时活细胞和 P2RY12+，则进行分类。 请点击这里查看此图的较大版本. 封闭人口 父项的频率 总频率 计数 S1系列 68.10% 68.10% 162186 S2>S1 93.59% 63.70% 151707 P2Ry12+ （670+） > S2 > S1 83.05% 52.90% 125986 直播 （525-） > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752 名爵 （P2RY12+ Live） >S2>S1 78.96% 50.30% 119794 表1： 示例世系表，其中包含门控百分比和预期事件编号。 2. 用于蛋白质表达分析的核内流动染色 注意：此时可以开始其他细胞类型，该协议使用培养细胞进行测试，包括 HEK293 细胞、BV2 小胶质细胞样细胞和人 IPSC 衍生的小胶质细胞。 细胞的固定和染色注意：对于以下方案，请使用针对核染色进行优化的细胞内染色试剂盒。看 材料表 用于产品推荐。将第 1.5.2 节的细胞外染色细胞等分到 96 孔板（5 x 104- 1 x 106 个细胞）中。在4°C下以500× g 离心细胞5分钟，轻弹以除去FACS缓冲液。注意：为了获得中位数水平高置信度的数据，每孔至少应使用10,000个细胞。虽然没有推荐的最大值，但最好在整个实验过程中保持细胞数一致，以确保不同变异系数 （CV） 没有显着影响。 固定和透化：加入 200 μL 1x 定影浓缩液，并与 P200 移液管轻轻混合以重悬细胞。在黑暗中孵育 45-60 分钟。 在室温（RT）下以500× g 离心板5分钟，轻弹弃上清液。注意：如有必要，此时可以暂停协议。弃去上清液后，将细胞重新悬浮在免疫细胞的长期储存缓冲液中（产品推荐见 材料表 ）。样品可在4°C下储存12-18小时，避光并覆盖透明薄膜以保护缓冲液蒸发。 向每个孔中加入 200 μL 1x 透化缓冲液，并用 P200 移液混合。在室温下以500×g离心板5分钟，轻弹弃去清液。重复透化缓冲液洗涤共3次。 制备流量对照品：从每个样品中分离出细胞体积，用于所需的流量控制品（每个对照孔 10,000-30,000 个细胞就足够了）。要制备无染色对照，请将分选或等分未染色细胞中的无染色细胞固定到不会接收任何抗体的单独孔中。 为了制备荧光减一 （FMO） 对照，将检测组合上除该通道中的抗体外的每种抗体的细胞分装细胞。 对于相关通道，在 FMO 中包括同型对照抗体进行门控。例如，在包含 P2RY12-APC 和 H3K27Ac-AlexaFluor568 的 panel 中，应该有两个 FMOS：（1） 仅包含 H3K27Ac-AlexaFluor568 和 P2RY12 同种型对照抗体的 APC-FMO，以及 （2） 仅包含 P2RY12-APC 和同种型对照一发性和 568 次级的 568-FMO。注意：该协议用于测试单个HPTM，但是可以建立包含许多与不同荧光团偶联的HPTM的panel。 一抗染色：向每个孔中加入 50 μL 含有适当浓度一抗的 1x 透化缓冲液。在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。用 200 μL 1x 透化缓冲液洗涤 2 次。注意：用于每种 HPTM 的抗体浓度包含在 材料表中。浓度是通过在用兴奋剂处理的培养细胞上测试不同浓度的抗体来确定的，这些兴奋剂会导致显着增加，例如，用于乙酰化标记的HDAC抑制剂，并确保未经处理和处理的细胞都在检测范围内（高于同型对照，低于细胞仪的最大检测范围）。HPTM 的最佳抗体浓度应在荧光基团通道中的平均中位荧光强度介于 5 x 104 和 1 x 105 之间。 二抗染色：用 200 μL 含有 2% 正常驴血清 （NDS） 的 1x 透化缓冲液在室温下封闭 10 分钟，在室温下以 500 x g 旋转 5 分钟，轻弹以除去上清液。 加入 50 μL 含 2% NDS 和适当浓度的 1x 透化缓冲液和适当浓度的二抗，并在室温下在黑暗中孵育 30 分钟。向孔中加入200μL 1x透化缓冲液稀释，在室温下以500× g 离心板5分钟，轻弹弃上清液。用 200 μL 1x 透化缓冲液洗涤细胞 2 次。注意：如有必要，此时暂停协议。用P200移液器将细胞重悬于200μL免疫细胞长期储存缓冲液中（参见材料 表 的建议），并在4°C下避光储存12-24小时。 准备流式细胞术：在室温下以500× g 离心板5分钟，轻弹弃去清液。使用 P200 移液器将细胞重悬于 200 μL FACS 缓冲液中进行流式细胞术。用透明薄膜密封，以便运输到细胞仪。 流式细胞术要分析建议的抗体组合，请确保细胞仪配备至少四种激光器，包括紫色 （405 nm）、蓝色 （488 nm）、黄色 （561 nm） 和红色 （633 nm）。流式细胞仪需要滤光片来检测 FITC（蓝色 525 nm）、KRO（紫色 525 nm）、PE（黄色 585 nm）和 APC（红色 660 nm）。根据所选的流式细胞仪添加其他抗体。 校准和标准化：在每个实验开始时，运行彩虹荧光珠并调整光电倍增管 （PMT） 电压，直到珠子峰值与先前实验的目标值相当。这种标准化方法允许适应设备随时间推移的漂移。 补偿：在为实验设置了PMT电压和增益后，使用抗体捕获的补偿珠建立抗体组合的补偿矩阵。该计算将确保荧光团不会导致其他通道中的信号变化。在多重检测多种抗体时，这一点越来越必要。 尺寸门控：在点图中，在对数上绘制 SSC-A 与线性在 FSC-H 上绘制。栅极栅出碎片并使用 S1 栅极选择单元大小。在 FSC-W 与 FSC-H 的点图中选择单线态细胞，并将栅极设置为 S2。（图 4）。 建立荧光基团门：使用每个荧光团通道的相关FMO，建立门，使用单参数直方图确定每个通道中的正信号（图4）。 测量样品：使用既定的门控策略仔细记录样品。使用 P2RY12+ 信号识别小胶质细胞，仅确定小胶质细胞相应通道中蛋白质的表达。 流式细胞术数据分析建立分析门：在分析软件用户界面上对流式细胞仪使用上述步骤，使用用于记录分析的相同门。 使用流式细胞术分析软件获得 MFI 值（参见材料 表 以获取建议）：概括用于流式分析的流式细胞仪门控策略。使用添加统计函数，为补偿通道高度上的感兴趣总体（例如，568+）选择中位数。使用表格编辑器，将相应通道的中值荧光强度 （MFI） 值导出到电子表格中以进行统计分析（表 2）。注意： 补充文件 S1 包括来自脂多糖 （LPS） 和磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 注射小鼠的示例数据以及具有门控策略和 MFI 值的示例分析文件。 分析 MFI 值与蛋白质倍数变化：获得 MFI 值后，计算 MFI 相对于对照组或未处理群体的倍数变化（公式 1）。MFI的倍数变化反映了蛋白质水平的倍数变化。使用倍数变化值，评估表达的变化，并使用 t 检验或方差分析计算统计显着性。等式 1 图 4：蛋白质 MFI 评估的门控策略。 首先针对 SSC-A 与 FSC-H （S1） 上的单元大小对事件进行门控。然后对细胞进行门控，以获得 FSC-H 与 FSC-W （S2） 上的单线态。然后通过 P2RY12-APC 信号 （APC+） 将单线态细胞鉴定为小胶质细胞，并在含有同型对照抗体的 APC-FMO 对照中基于荧光建立门。然后对细胞进行 Comp-FL5-A：：Y610-mCherry 上的 H3K27Ac-AlexaFluor568 信号门控。610+细胞的荧光强度被确定为蛋白质表达的代表。 请点击这里查看此图的较大版本.