Zebrafish Radial Glia Progenitors의 비대칭 분열 동안 Notch/Delta Endocytosis 추적을 위한 항체 흡수 분석
Summary
이 작업은 배아 제브라피쉬 뇌의 방사형 신경교 전구체를 분할할 때 계통 내 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 개발합니다.
Abstract
서로 다른 운명의 두 딸 세포를 생성하는 비대칭 세포 분열(ACD)은 세포 다양성을 생성하는 데 기본이 됩니다. 무척추 동물과 척추 동물의 발달 기관에서 비대칭으로 분열하는 선조는 Notchhi 자가 재생 및 Notchlo 차별화 딸을 생성합니다. 배아 제브라피쉬 뇌에서 주요 척추동물 신경 줄기 세포인 방사형 신경교 전구세포(RGP)는 대부분 ACD를 거쳐 하나의 RGP와 하나의 분화 뉴런을 낳습니다. 제브라피쉬 배아의 광학적 선명도와 쉬운 접근성은 ACD 동안 Notch 신호의 비대칭성이 언제 어떻게 설정되는지 직접 시각화하기 위한 생체 내 타임랩스 이미징에 이상적입니다. 최근 연구에 따르면 Notch 리간드 DeltaD의 동적 엔도사이토시스는 ACD 동안 세포 운명 결정에 중요한 역할을 하며, 이 과정은 진화적으로 보존된 극성 조절자 Par-3(Pard3라고도 함)과 다인 운동 복합체에 의해 조절됩니다. 유사분열 RGP에서 Notch 신호 엔도솜의 생체 내 트래피킹 패턴을 시각화하기 위해 우리는 이 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 분석을 사용하여 RGP 분열 동안 DeltaD 함유 엔도솜의 역학을 밝혀냈습니다.
Introduction
노치 신호전달은 후생동물에서 발달하는 동안 세포의 운명 결정과 패터닝을 조절하며1, 최근 연구에 따르면 줄기세포 분열에서의 노치 신호전달은 주로 세포내 이동에 의존하는 것으로 나타났다 2,3. 엔도사이토시드 노치/델타는 핵에서 노치 신호전달을 활성화하고 노치 표적 유전자 4,5,6의 전사를 향상시킬 수 있습니다. 방향성 노치/델타 엔도솜 트래피킹은 비대칭 세포 분열(ACD) 동안 초파리 감각 기관 전구체(SOP) 세포에서 처음 관찰되었으며, 그 결과 pIIb 7,8보다 pIIa에서 더 높은 Notch 신호 전달 활성을 보였습니다. 유사분열 SOP 세포의 세포내 과정을 모니터링하기 위해 항-델타 및 항-노치 항체를 사용한 항체 흡수 분석이 적용되었습니다. Notch/DeltaD 엔도솜은 세포분열 동안 키네신 운동 단백질과 함께 중앙 방추체로 이동하고, 세포 분열의 마지막 순간에 비대칭 중심 방추의 역평행 배열로 인해 pIIa 세포로 비대칭적으로 전위됩니다 3,8. 이러한 연구는 초파리 SOP 세포에서 비대칭 분열을 조절하는 분자 메커니즘에 대해 밝혔지만 유사한 내세포 과정이 척추동물 방사형 신경교 전구체(RGP)에서 발생하는지 여부는 불분명합니다.
더욱이, 척추동물 RGP 분열 동안 비대칭 Notch/DeltaD 신호 전달을 조절하는 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 제브라피쉬에서 Notch와 Delta의 상호작용은 DeltaD 리간드9의 엔도사이토시스를 촉진하는 것으로 보고되었습니다. DeltaD 엔도사이토시스가 발달 중인 척추동물 뇌에서 딸 세포의 세포 운명 선택에 영향을 미칠 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. 최근 연구에 따르면 형광 접합 항-DeltaD 항체를 신경관에 주입하면 신경상피 세포에서 Sara 엔도솜을 특이적으로 표지할 수 있으며, Sara 엔도솜을 함유한 항-DeltaD는 증식하는 딸 세포로 우선적으로 분리된다10. 엔도솜의 Notch 신호 전달이 딸 세포의 운명을 조절할 수 있다고 제안되었습니다. 이전 결과는 발달 중인 전뇌에서 대부분의 제브라피쉬 RGP 세포가 ACD를 겪고, 딸 세포의 운명 결정은 혈통 내 Notch/DeltaD 신호11에 의존한다는 것을 보여주었다. 제브라피쉬 RGP에서 intralineage Notch/DeltaD 신호 전달의 특성을 설명하기 위해 우리는 제브라피쉬 발달 뇌에서 항-DeltaD 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 유사분열 RGP에서 DeltaD 내세포 트래피킹의 실시간 라벨링 및 이미징을 성공적으로 수행했습니다.
형광 표지된 항-DeltaD 항체는 전뇌 심실을 따라 RGP에 효율적으로 내재화됩니다. 그것은 비대칭적으로 분열하는 RGP12,13에서 DeltaD 엔도솜의 방향성 트래피킹의 발견을 크게 촉진했습니다. 초파리 노텀 배양 및 제브라피쉬 척수10을 위해 개발된 이전 항체 흡수 프로토콜과 비교하여 이 프로토콜은 특히 10nL 미만의 미세 주입된 항체 혼합물로 뇌실 세포층에서 오래 지속되고 매우 효율적인 항-DeltaD 라벨링을 달성했습니다. 후뇌 심실 주사는 제브라 피쉬 배아에서 후뇌 심실이 잘 확장되고 초기 발달 단계14에서 뇌척수액으로 채워지기 때문에 발달중인 뇌에 항체 흡수 분석을 적용하는 데 매우 편리합니다. 중요한 발달 조직을 손상시키지 않고 항체 혼합물을 후뇌 심실에 주입함으로써 프로토콜은 전뇌의 이미징 영역에 대한 가능한 손상을 최대한 최소화했습니다. 주입된 1차 항체의 감소된 용량은 또한 생체 내에서 내인성 Delta-Notch 신호 전달을 방해하는 잠재적인 부작용을 피했습니다. 이 프로토콜은 다른 약리학적 또는 유전적 섭동과 쉽게 결합할 수 있고, 다양한 발달 단계에서 활용될 수 있으며, 성인 뇌와 인간 만능 줄기 세포 유래 2D/3D 뇌 오가노이드에 적용될 수 있습니다. 종합하면, 이 프로토콜을 통해 ACD 동안 Notch 신호 비대칭이 언제 어떻게 설정되는지 이해할 수 있습니다. 이 프로토콜의 성공적인 구현을 위한 주요 과제는 특정 실험 조건에 따라 적절한 농도의 항체를 정확하게 전달하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 제브라피쉬 방사형 신경교 전구체의 엔도솜 노치/델타 트래피킹을 고효율로 표지하고 이미징하기 위한 항체 흡수 분석을 개발했습니다. 초파리 SOP 세포7,8에서 표지된 항-DeltaD 항체를 추적하는 데 사용된 이전 방법과 비교하여, 우리의 방법은 접합 항체에서 샘플을 배양하는 대신 미세주입을 사용했습니다. 형광 접합 항-Dld 항체를 후뇌 심실에 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 NIH R01NS120218, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation 및 Chan Zuckerberg Biohub의 지원을 받았습니다.
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
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