JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Erişkin Drosophila Melanogaster'de Kimyasal Toksisitenin Değerlendirilmesi

Published: March 24, 2023
doi:
10.3791/65029
, , , , , , ,
1Department of Biology,Indiana University, 2Bloomington Drosophila Stock Center, Department of Biology,Indiana University, 3School of Biosciences,University of Birmingham, 4O’Neill School of Public and Environmental Affairs,Indiana University, 5Section of Developmental Genomics, Laboratory of Biochemistry and Genetics, National Institute of Diabetes and Kidney and Digestive Diseases,National Institutes of Health

Summary

Bu protokol, kimyasal toksik maddelerin yetişkin Drosophila melanogaster’in yaşayabilirliği üzerindeki etkilerini değerlendirmek için sıvı ortam kullanan verimli ve ucuz bir yöntemi tanımlamaktadır.

Abstract

İnsan endüstrileri, birçoğu çevre güvenliği veya insan sağlığı üzerindeki etkileri için yeterince çalışılmamış yüz binlerce kimyasal madde üretmektedir. Bu kimyasal güvenlik bilgisi eksikliği, memelilerde pahalı, emek yoğun ve zaman alıcı olan mevcut test yöntemleriyle daha da kötüleşmektedir. Son zamanlarda, bilim adamları ve düzenleyiciler, daha ucuz, daha hızlı ve hayvanların acı çekmesini azaltan kimyasal güvenlik testleri için yeni yaklaşım metodolojileri (NAM’ler) geliştirmek için çalışıyorlar. Ortaya çıkacak en önemli NAM’lardan biri, omurgasız organizmaların, insanlar da dahil olmak üzere uzaktan ilişkili türler arasında korunmuş kimyasal etki modlarını aydınlatmak için memeli modellerinin yerine kullanılmasıdır. Bu çabaları ilerletmek için, burada, kimyasal güvenliği değerlendirmek için meyve sineği Drosophila melanogaster’i kullanan bir yöntemi açıklıyoruz. Protokol, maruz kalan yetişkin sineklerin yaşayabilirliğini ve beslenme davranışını ölçmek için basit, hızlı ve ucuz bir prosedürü açıklar. Ek olarak, protokol genomik ve metabolomik yaklaşımlar için örnekler oluşturmak üzere kolayca uyarlanabilir. Genel olarak, protokol Drosophila’nın hassas toksikolojide kullanılmak üzere standart bir model olarak kurulmasında ileriye doğru atılmış önemli bir adımı temsil etmektedir.

Introduction

İnsanlar sürekli olarak hava1, gıda 2, su3,4, ilaçlar5, temizlik maddeleri6, kişisel bakım ürünleri 7, endüstriyel kimyasallar 7 ve yapı malzemeleri 7 dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan gelen kimyasallara maruz kalmaktadır. Ayrıca, her yıl binlerce yeni kimyasal madde tanıtılmaktadır8, bunların çoğu sağlık ve çevre güvenliği için uygun şekilde incelenmemiştir. Yeterli kimyasal güvenlik testinin olmaması, kısmen fareler ve sıçanlar gibi memeli modellerine aşırı bağımlılıktan kaynaklanmaktadır. Bu tür kemirgen modelleri bilgilendirici olsa da, bu sistemlerdeki kimyasal güvenlik testleri pahalıdır, zaman alıcıdır ve genellikle test hayvanına kabul edilemez seviyelerde acı çekmesine neden olur9.

Memeli kimyasal güvenlik testi ile ilişkili finansal ve etik yüklerin yanı sıra memeli çalışmalarının zaman alıcı doğası, yeni kimyasalları çevreleyen verilerin yetersizliğine katkıda bulunan başlıca faktörlerdir. Bu sorunu ele almak için, ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA), Avrupa Kimyasallar Ajansı (ECHA), Health Canada ve diğer kurumlar, yeni yaklaşım metodolojilerini (NAM’ler) düzenleyici çerçevelere dahil eden önlemler uygulamaktadır10, böylece Kuzey Amerika ve Avrupa politikasını, hayvanların kullanımını değiştirmek, azaltmak ve iyileştirmek için uluslararası hedeflerle uyumlu hale getirmektedir (3R ilkesi)11, 12,13,14. NAM’lar, öncelikle memeli test türlerine uygulanan sıkıntıları gözlemlemek yerine kimyasal toksisitenin mekanik bir anlayışını sağlayan, böylece kimyasal risk değerlendirmesi için veri üretme oranını artıran in vitro ve in silico modellere dayanan çeşitli tahlilleri kapsar ve yine de yüksek doğrulukta çıktılarüretir15. Bununla birlikte, bu yöntemlerin, organlar arası iletişim ve endokrin sinyalizasyonu içeren hayati biyolojik süreçlerin bozulması da dahil olmak üzere sistemik toksisiteye karşı koruma sağladığı henüz kanıtlanmamıştır. Ayrıca, belirli dokulardaki kimyasalların biyobirikimini, bireysel bileşiklerin emilme ve salgılanma yeteneğini ve davranış ile kimyasal maruziyet arasındaki etkileşimi açıklayamazlar.

İn vitro ve hesaplamalı modellerin sınırlamaları nedeniyle, memeli modellerini azaltmak veya değiştirmek için NAM’lerin başarılı bir şekilde kullanılması, meyve sineği, Drosophila melanogaster gibi omurgasız in vivo modelleri de içermelidir. Sineklerde yapılan önceki çalışmalar, bu organizmanın, hayvan hücrelerini toksik moleküllere karşı koruyan korunmuş genetik yolları incelemek için çok uygun olduğunu göstermiştir 16,17,18,19,20,21,22. Dahası, sinek, insan hastalıklarının% 65’inden fazlasına fonksiyonel homologlar 23,24,25 ve önemli fonksiyonel yolların daha da fazla korunması 26 dahil olmak üzere insanlarla dikkate değer genetik benzerlik göstermektedir. Bu özellikler, nispeten kısa yaşam döngüleri, düşük bakım maliyetleri ve kolayca gözlemlenebilir davranışsal tepkileri ile birleştiğinde, Drosophila’yı toksikolojik bir model olarak kullanım için çok uygun hale getirir27,28,29,30. Dahası, sinekler kemirgen modellerinden çok daha yüksek verime sahiptir ve diğer organizma dışı NAM’lar tarafından kolayca tespit edilemeyen metabolizma, fizyoloji ve hormon sinyalleri üzerindeki etkileri yakalar9.

Burada açıklanan protokol, kimyasal maruziyetin yetişkin Drosophila üzerindeki etkilerini test etmek için bir çerçeveyi temsil etmektedir. Yöntem, verimli, ucuz ve tekrarlanabilir olacak şekilde tasarlanırken, aynı zamanda araştırmacıların test kimyasalı ile temas halinde olmaları ve metabolomik ve diğer omik yaklaşımlar için numune toplama ile temas halinde olmaları gereken süreyi en aza indirir. Protokol, deney başına tek bir kimyasalı test etmek için optimize edilmiştir, ancak çeşitli çözücüler veya kimyasal kombinasyonları gibi diğer deneysel parametreleri kolayca barındırabilir.

Protocol

NOT: Bu protokoldeki tüm adımlar için nitril eldiven giyin. Değerlendirilen her kimyasal için güvenlik bilgi formlarına göre bir laboratuvar önlüğü, göz koruması ve / veya solunum cihazı kullanın. 1. Flakon ve nem odası hazırlama NOT: Adım 1.1-1.5, diğer deneysel bölümlere başlamadan önce herhangi bir zamanda tamamlanabilir. Kontaminasyonu önlemek için nitril eldivenler flakon hazırlığı sırasında her zaman giyilmelidir. Dört yaprak 1. sınıf selüloz kromatografi kağıdını istifleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları geniş şeritler halinde 2’ye bölün. Çiçek şeklindeki filtre kağıdı eklerini, çiçek şeklinde bir kalıp içeren 1,5 inç kağıt zımba kullanarak delin. Filtre kağıdını 28,5 mm çapında bir polipropilen şişenin altına itmek için 22 mm x 220 mm verniksiz ahşap dübel kullanın. Filtre kağıdı yığınının şişenin altına güvenli bir şekilde yerleştirildiğini onaylayın. Hazırlanan şişeleri plastik veya karton tepsilerde saklayın ve tepsileri kullanıma kadar büyük (~ 280 mm x 240 mm) plastik torbalara yerleştirin. 606,24 mm x 225,42 mm x 403,22 mm plastik küvetin plastik kapağında 120 mm x 280 mm’lik bir delik açarak bir nem odası oluşturun ( bkz. Hava akışına izin vermek için ağı deliğin üzerine yapıştırın. Plastik ızgaranın bir bölümünü, adım 1.4’te kullanılan plastik küvetin dibine sığacak şekilde panjurlu tavan ışık panellerinden (orijinal olarak 610 mm x 1220 mm) kesin.NOT: Bir nem odası oluşturmak için çeşitli farklı plastik küvetler ve plastik/metal ızgara malzemeleri kullanılabilir. 2. Sinek yetiştiriciliği Standart Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) ortamını içeren cam süt şişelerinde yetişkin sineklerin (en az 30 yetişkin) kültürlerini başlatın31. Şişeleri, hassas bir görev mendiline sarılmış bir rayon tapasıyla kapatın. Şişeleri kalabalıklaştırmayın.NOT: Gerekli şişelerin sayısı, yürütülen kimyasal maruziyetlerin sayısına ve test suşunun genotipine bağlıdır. Normalde, sağlam ve verimli stoklar kullanıldığında tek bir şişeden birkaç yüz sinek elde edilebilir. Standart tahlil Oregon-R vahşi tip sinekleri kullanır (BDSC stok # 2057), ancak ilgilenilen herhangi bir genotip (ler) bu protokolle kullanılabilir. Düşük doğurganlık ve / veya canlılığa sahip tehlikeye atılmış genotiplerin şişe kültürlerinin artmasını gerektirdiğini unutmayın. Kültür şişelerinin tepsilerini 25 ° C’de yaklaşık% 60 nem ve 12: 12 saat ışık: karanlık döngü ile üçüncü larva instar veya erken pupa aşamaları gözlenene kadar inkübe edin. Bu aşama, şişenin kenarlarında dolaşan larvaların varlığı ve şişe duvarlarında pupaların ortaya çıkması ile tanımlanabilir.NOT: sinekleri sadece 12:12 saat ışık:karanlık döngüsünün ışıkların yandığı süre boyunca tutun. Sağlam stoklar için, şişeler açıklanan koşullar altında 3-4 gün sonra bu aşamaya ulaşır.Yetişkin sinekleri çıkarın ve medyanın likiditesini belirleyin. Medya ters çevrildiğinde şişenin kenarı boyunca akarsa, ortam çok sıvıdır. Sinek yemini katılaştırmak için şişenin altına hassas bir görev mendili veya bir rayon topu yerleştirin. Sinekler kapanmaya başladığında, tüm yetişkinleri şişelerden temizleyin ve pupaların 48 saat boyunca kapanmaya devam etmesine izin verin. Bu noktada, kültür şişelerinden temizlenen herhangi bir yetişkin, stokları yaymak için yeni şişelere aktarılabilir (bkz. adım 2.1) veya atılabilir. 48 saatlik periyotta kapanan sinekleri standart BDSC ortamı içeren yeni şişelere aktarın. 3 gün boyunca yaşlandırın.NOT: Bu biberonlardaki yetişkinler 3-5 günlüktür ve öldürücülük ve beslenme deneylerinde kullanılabilir. Yetişkin sinekleri yaşlandırmak için kullanılan şişeler yumurta ve larva içerecektir. Sonuç olarak, bu şişeler yeni nesil sinekleri yaymak için kullanılabilir. 3. Kimyasal maruziyet için sineklerin hazırlanması 5-7 günlük sinekleri CO2 ile uyuşturun. Anestezi uygulanan sinekleri cinsel organlarını kullanarak cinsiyete göre sıralayın. Anestezi ve sineklere seks yapma konusunda yardım için, referans28’e bakınız. 20 erkek veya 20 dişi sineklerden oluşan grupları, standart BDSC ortamı içeren şişelere yerleştirin. Şişeyi bir rayon tapasıyla kapatın ve erkek ve dişi şişeleri ayrı ayrı saklayın. Dişi sinekler içeren şişeleri bir şeritle işaretleyin. Yanlışlıkla cinsiyetleri karıştırmaktan kaçınmak için şişeleri erkek sineklerle işaretlenmemiş halde bırakın.NOT: Adım 3.2’de hazırlanması gereken şişelerin sayısı, maruz kalma deneylerinin boyutuna göre belirlenir. Adım 5.3 ve 5.6’da açıklandığı gibi, tek bir test kimyasalı için tipik bir aralık bulma deneyi, en az 40 şişe erkek ve 40 şişe dişi gerektirir. Adım 7.4 ve 7.8’de açıklanan standart bir doz-yanıt eğrisi deneyi, en az 63 şişe erkek ve 63 şişe dişi gerektirir. Şişeleri 48 saat boyunca bir inkübatörde 25 ° C’de yaklaşık% 60 nemde ve 12:12 saat ışık: karanlık döngü ile saklayın. Bu süre zarfında, anesteziden kurtulurken sineklerin yiyeceğe sıkışmasını önlemek için sıralanmış şişelerin tepsisini 60 ° ‘lik bir açıyla yerleştirin.NOT: Bu adım, sineklerin CO2 anestezisinden iyileşmesini sağlar. Maruz kalma protokolünün geri kalanında sinekleri tekrar uyuşturmayın. 48 saatlik iyileşme süresinden sonra, adım 1.3’te hazırlanan şişelere 0.75 mL steril arıtılmış su ekleyin. Bu adımda hazırlanan şişe sayısı, adım 3.2’de ayarlanan şişe sayısıyla aynı olmalıdır. Sıralanmış, cinsiyete uygun sinekleri, adım 3.2’den itibaren sinekleri içeren cam şişeyi açlık şişesine aç şişesine aktarın, hazırlanan plastik şişenin ağzına koyun ve ardından plastik şişenin tabanını bir tezgahın üstüne vurun. Plastik şişeyi bir selüloz asetat tapasıyla kapatın (genellikle flug olarak bilinir).Bu transferde kaybolan sinekleri kaydedin (daha sonra her flakon için başlangıç sinek sayısının kayıtlarına aktarın). Dişi sinekleri içeren açlık şişelerini bir şeritle işaretleyin. Yanlışlıkla cinsiyetleri karıştırmaktan kaçınmak için şişeleri erkek sineklerle işaretlenmemiş halde bırakın. Nem odasını gece boyunca maruz kalmaya hazırlayın. Bu odanın nasıl inşa edileceğine ilişkin bir açıklama için 1.4-1.5 arası adımlara bakın.Nem odasının altına altı standart kağıt havlu yerleştirin. Kağıt havluları 100 mL su ile ıslatın. Şişelerin doymuş kağıt havlularla temas etmemesini sağlamak için plastik ızgarayı (adım 1.5) ıslak havluların üzerine koyun. Açlık şişelerinin tepsilerini nem odaları içinde yatay bir konuma yerleştirin. Nem odalarını gece boyunca 25 ° C’lik bir inkübatöre (yaklaşık% 60 nemde) yerleştirin.NOT: İdeal olarak, gece açlık süresi yaklaşık 16 saat sürer; ancak, zamanlama bireysel laboratuvar programları için ayarlanabilir. 4. Stok çözümlerinin hazırlanması NOT: Sinekler, maya-sakkaroz sıvı ortamında test kimyasalları ile beslenir. Bu bölümde, konsantre besleme ortamlarının stok çözeltilerinin hazırlanması ve test kimyasalları açıklanmaktadır. Steril arıtılmış suda çözünmüş% 16 sakkaroz ve% 6 maya ekstraktı (m / v) içeren 4x maya-sakkaroz çözeltisi hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Uygun sterilizasyon süresi için çözeltiyi bir sıvı döngüsünde otoklavlayın (örneğin, 1 L için 40 dakika).NOT: Çözelti dökme olarak yapılabilir ve -20 °C’de alikotlarda saklanabilir. Tek tek alikotları kullanımdan 1 gün önce 4 °C’lik bir buzdolabına koyarak çözün. Test kimyasalının bir stoğunu hazırlayın. İlk deney için, stok çözeltisi en yüksek konsantrasyonda yapılmalıdır, böylece kimyasal suda tamamen çözülebilir.NOT: Test kimyasalını çözmek için su dışındaki çözücüler kullanılabilir. Alternatif çözücülerin kullanımına ilişkin uyarılarla ilgili tartışmaya bakın. 1 g FD&C Blue No. 1’i ( Malzeme Tablosuna bakınız) 10 mL steril arıtılmış suda çözerek 100x mavi boya stok çözeltisi hazırlayın.NOT: Mavi boya stok çözeltisi dökme olarak yapılabilir ve 4 °C’de alikotlarda saklanabilir. 5. Maruz kalma şişelerinin hazırlanması: Aralık bulma deneyi NOT: Protokolün 5. ve 6. adımları, 0 öldürücülüğe neden olan en düşük test kimyasalı dozunu ve ölümcül bir fenotipi indükleyemeyen en yüksek dozu tanımlamak için tasarlanmıştır. Bu konsantrasyonlar önceki deneylerle zaten belirlenmişse, bir doz-yanıt eğrisini hesaplamak için adım 7 ve 8’e bakın. Maruz kalma ortamı, maruz kalma şişelerine sinek eklenmeden hemen önce hazırlanmalıdır. Sekiz adet 15 mL santrifüj tüpünü aşağıdaki gibi etiketleyin: (i) kimyasal içermez, (ii) en yüksek konsantrasyon, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ve 1:1.000. Etiketli santrifüj tüplerindeki pozlama ortamını, önce sekiz etiketli tüpün tümüne 2,5 mL 4x maya/sakkaroz stok çözeltisi ekleyerek adım 5.1’den itibaren hazırlayın.”Kimyasal yok” etiketli tüpe 7,5 mL steril arıtılmış su ekleyin. Bu seyreltme negatif kontroldür. “En yüksek konsantrasyon” etiketli tüpe 7.4 mL test kimyasal stok çözeltisi ekleyin. Bu tüpe 100 μL steril arıtılmış su ekleyin, böylece nihai hacim 10 mL’dir. Bu çözeltideki test kimyasalının molaritesini hesaplayın ve kaydedin.NOT: Tüpe 100 μL steril arıtılmış su ilavesi, bu adımdaki kimyasal konsantrasyonun, besleme davranışını değerlendirmek için bir yöntem olarak maruz kalma ortamına mavi bir boya stok çözeltisinin eklendiği adım 5.5’te kullanılanla aynı olmasını sağlar. Kalan tüplere uygun miktarda test kimyasal stok çözeltisi ve steril arıtılmış su ekleyin. Her tüpün son hacmi 10 mL olmalıdır. Bu tüplerdeki test kimyasallarının “en yüksek konsantrasyonlu” tüpe göre nihai konsantrasyonu 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200 ve 1: 1.000 olmalıdır. Adım 5.1’de oluşturulan her bir maruz kalma ortamı konsantrasyonu için sekiz pozlama şişesi hazırlayın ve etiketleyin. Aşağıdaki etiketleri içeren sekiz şişe seti (toplam 64 şişe) olmalıdır: kimyasal yok, en yüksek konsantrasyon, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ve 1:1.000.Adım 5.2.3’te hazırlanan 0,75 mL pozlama ortamı pipeti, ilgili pozlama şişeleri setine yerleştirilir. Sekiz adet 5 mL tüpü aşağıdaki gibi etiketleyin: (i) kimyasal içermez, (ii) en yüksek konsantrasyon, (iii) 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ve 1:1.000. İlk önce 500 μL 4x maya/sakkaroz stok çözeltisi ve 20 μL mavi boya stok çözeltisini sekiz etiketli 5 mL tüpte karıştırarak mavi boyaya maruz kalma ortamı hazırlayın.”Kimyasal yok” etiketli tüpe 1,48 mL steril arıtılmış su ekleyin. Bu seyreltme negatif kontroldür. “En yüksek konsantrasyon” etiketli tüpe 1.48 mL test kimyasal stok çözeltisi ekleyin. Bu tüpe su eklenmez. Bu çözeltideki test kimyasalının molaritesini hesaplayın ve kaydedin. Kalan tüplere uygun miktarda test kimyasal stok çözeltisi ve steril arıtılmış su ekleyin. Her tüpün son hacmi 2 ml olmalıdır. Bu tüplerdeki “en yüksek konsantrasyonlu” tüpe göre test kimyasalının nihai konsantrasyonu 1: 2, 1: 10, 1: 20, 1: 100, 1: 200 ve 1: 1.000 olmalıdır. Her bir mavi pozlama ortamı konsantrasyonuyla iki pozlama şişesi hazırlayın ve etiketleyin. Aşağıdaki etiketleri içeren sekiz şişe seti (toplam 16 şişe) olmalıdır: kimyasal yok, en yüksek konsantrasyon, 1:2, 1:10, 1:20, 1:100, 1:200 ve 1:1.000. Bu şişelerin üzerine “mavi” kelimesi de yazılmalıdır.0,75 mL mavi pozlama ortamını ilgili mavi pozlama şişeleri setine pipetin. 6. Sinek kimyasal maruziyeti: Aralık bulma deneyi Adım 3.7’den itibaren gece boyunca aç bırakılan sineklerin şişelerini kullanarak kimyasal maruz kalma şişelerini aşağıdaki gibi hazırlayın:Dört şişe aç dişi sineği (şişe başına 20 sinek) her kimyasal konsantrasyonda dört maruz kalma şişesine aktarın. Bu şişeleri “dişi” olarak etiketleyin. Adım 3.5’te açıklanan aynı aktarım yöntemini kullanın. Dört şişe aç erkek sineği (şişe başına 20 sinek) her kimyasal konsantrasyonun dört maruz kalma şişesine aktarın. Bu şişeleri “erkek” olarak etiketleyin. Adım 3.5’te açıklanan aynı aktarım yöntemini kullanın. Adım 3.7’den itibaren gece boyunca aç bırakılan sineklerin şişelerini kullanarak mavi boya içeren kimyasal maruz kalma şişelerini aşağıdaki gibi hazırlayın:Açlıktan ölen dişi sineklerin bir şişesini (şişe başına 20 sinek) her kimyasal konsantrasyon için bir mavi maruz kalma şişesine aktarın. Bu şişeyi “dişi” olarak etiketleyin. Adım 3.5’te açıklanan aynı aktarım yöntemini kullanın. Açlıktan ölen erkek sineklerin bir şişesini (şişe başına 20 sinek) her kimyasal konsantrasyon için bir mavi maruz kalma şişesine aktarın. Bu şişeyi “erkek” olarak etiketleyin. Adım 3.5’te açıklanan aynı aktarım yöntemini kullanın. Transferden sonra her şişede bulunan sinek sayısını kaydedin ve ölen veya kaçan sayıyı not edin. Normalde, 20 sineğin tümü bir gecede açlıktan ve transferden kurtulmalıdır. Pozlama şişelerini yatay olarak yeni hazırlanmış nem odalarına yerleştirin (nem odası hazırlığı için adım 3.6’ya bakın). Odaları yaklaşık% 60 nem ve 12:12 saat ışık: karanlık döngüsüne sahip 25 ° C’lik bir inkübatöre yerleştirin. Maruz kalma şişelerini, kimyasal maruziyetin başlamasından 24 ve 48 saat sonra inceleyin. Her zaman noktasında her şişedeki ölü sineklerin sayısını sayın ve kaydedin.NOT: Ölüm, bu tahlilin okunması için kullanılır, ancak protokol diğer fenotipleri incelemek için uyarlanabilir. Maruz kalan sinekler, transkriptomik ve metabolomik çalışmalar için bu zaman noktalarında yaygın olarak toplanır. Mavi maruz kalma şişelerini, kimyasal maruziyetin başlamasından 24 saat sonra inceleyin. Maruz kalan sineklerin mavi maruz kalma ortamını tüketip tüketmediğini belirlemek için aşağıdaki teknikleri kullanın:Flakon duvarlarını, maruz kalma şişesinin yanında ve flug üzerinde küçük noktalar olarak görünen mavi dışkı belirtileri için inceleyin. Sinekleri CO2 ile uyuşturun ve karınları mavi boya varlığı açısından inceleyin.NOT: Normalde, mavi pozlama şişeleri 24 saat sonra analiz edilir. Ancak, bu adım bunun yerine 48 saatte gerçekleştirilebilir. Normalde yemek yiyen sineklerin karnından mavi bir şerit vardır, bu da maruz kalma ortamının bağırsağa girdiğini gösterir. Sinekleri, yetersizlik, mahsul distansiyonu ve bağırsak bariyer fonksiyonunun bozulması gibi anormal beslenme davranışları açısından inceleyin (genellikle şirinlik32,33 olarak adlandırılan GI sistemi ile sınırlı kalmak yerine, organizma boyunca mavi boyanın ortaya çıkmasıyla gösterilir). Kirlenmiş tüm şişeleri, filtre kağıdını, flug’ları ve sinekleri uygun kimyasal atık kaplarına atın. Canlı sinekler şişelerde kalırsa, uygun atık kabına atmadan önce sinekleri öldürmek için şişeleri dondurun.NOT: Maruz kalma şişelerinin ve sineklerin bertarafı, deneyde analiz edilen kimyasal (lar) tarafından belirlenir. Her zaman kimyasal güvenlik bilgi formunda belirtilen kimyasal güvenlik prosedürlerini takip edin. Aralık bulma deneyinde kullanılan konsantrasyonlar sinekleri en düşük dozda öldürürse, hayvanların% 100’ünü öldüren en düşük konsantrasyondan başlayarak bir seyreltme serisi kullanarak bölüm 6’yı tekrarlayın. 7. Maruziyet şişelerinin hazırlanması: Bir doz-yanıt eğrisi oluşturma NOT: Adım 5 ve 6’da özetlenen protokol, bir fenotipi ortaya çıkarmak için gereken kimyasal konsantrasyonu geniş ölçüde belirlemek için tasarlanmıştır. Protokolün 7. ve 8. adımları, doğru bir doz-yanıt eğrisini hesaplamak için kullanılır. Aşağıdaki yöntemi kullanarak bir doz-yanıt eğrisi oluşturmak için analiz edilmesi gereken test kimyasal konsantrasyonlarını hesaplayın:48 saatte maruz kalan sineklerin% 100’ünü öldüren test kimyasalının en düşük konsantrasyonunu belirleyin. 48 saatte canlılık üzerinde hiçbir etkisi olmayan en yüksek test kimyasalı konsantrasyonunu belirleyin. 7.1.1 ve 7.1.2 adımlarında belirlenen konsantrasyonlar arasında eşit olarak dağılmış ek dört konsantrasyon hesaplayın. Aşağıdaki konsantrasyonların molaritesine sahip dokuz ayrı 15 mL santrifüj tüpünü etiketleyin: (i) kimyasal madde yok, (ii) adım 7.1.1’de belirlenen konsantrasyon, (iii) adım 7.1.2’de belirlenen konsantrasyon, (iv) 7.1.3’te belirlenen konsantrasyonlar, (v) adım 7.1.1’de belirlenen konsantrasyonun iki katı, (vi) adım 7.1.2’de belirlenen konsantrasyonun 1:2 seyreltilmesi.NOT: 7.1.1’de belirlenen konsantrasyonun iki katı olan konsantrasyonları ve adım 7.1.2’de belirlenenin 1:2 seyreltmesini dahil etmek, doz-yanıt eğrisinin doğru bir şekilde hesaplanması için önemlidir. Adım 7.2’de hazırlanan dokuz etiketli ayrı 15 mL santrifüj tüpüne önce 2,5 mL 4x maya/sakkaroz stok çözeltisi ekleyerek pozlama ortamını hazırlayın.”Kimyasal yok” etiketli tüpe 7,5 mL steril arıtılmış su ekleyin. Bu seyreltme negatif kontroldür. Kalan tüplere uygun miktarda test kimyasal stok çözeltisi ve steril arıtılmış su ekleyin. Her tüpün son hacmi 10 mL olmalıdır. Tek bir tüp içindeki son kimyasal konsantrasyonu, tüpün dışında yazılana eşit olmalıdır. Adım 7.2’de üretilen her bir maruz kalma ortamı konsantrasyonu için 12 pozlama şişesi hazırlayın ve etiketleyin. Dokuz şişe seti olmalıdır (toplam 108 şişe). 0,75 mL pozlama ortamını ilgili pozlama şişeleri setine pipetin.NOT: 7.6 ile 7.8 arasındaki adımlar isteğe bağlıdır. Adım 7.2’de hazırlanan test kimyasal konsantrasyonlarının beslenme davranışını etkilemediği biliniyorsa, bu adımlar atlanabilir. Adım 7.2’de kullanılan aynı konsantrasyon serisine sahip mavi pozlama ortamı için dokuz farklı 5 mL tüp hazırlayın ve etiketleyin. İlk önce 500 μL 4x maya/sakkaroz stok çözeltisi ve 20 μL mavi boya stok çözeltisini karıştırarak mavi boya maruz kalma ortamı hazırlayın.”Kimyasal yok” etiketli tüpe 1,48 mL arıtılmış steril su ekleyin. Bu seyreltme negatif kontroldür. Kalan tüplere uygun miktarda test kimyasal stok çözeltisi ve arıtılmış steril su ekleyin. Her tüpün son hacmi 2 mL olmalıdır. Tek bir tüp içindeki son kimyasal konsantrasyonu, tüpün dışında yazılana eşit olmalıdır. Mavi pozlama ortamının her bir konsantrasyonu için iki pozlama şişesi hazırlayın ve etiketleyin. Dokuz şişe seti (toplam 18 şişe) olmalı ve her bir şişe seti adım 7.2’de listelenen konsantrasyonlarla etiketlenmelidir. Bu şişelerin üzerine “mavi” kelimesi de yazılmalıdır.0,75 mL mavi pozlama ortamını ilgili mavi pozlama şişeleri setine pipetin. 8. Sinek kimyasal maruziyeti: Bir doz-yanıt eğrisi oluşturma Adım 3.7’den itibaren gece boyunca aç bırakılan sineklerin şişelerini kullanarak kimyasal maruz kalma şişelerini aşağıdaki gibi hazırlayın:Altı şişe aç dişi sineği (şişe başına 20 sinek) her kimyasal konsantrasyonun altı maruz kalma şişesine aktarın. Bu şişeleri “dişi” olarak etiketleyin. Adım 3.5’te açıklanan aynı aktarım yöntemini kullanın. Altı şişe aç erkek sineği (şişe başına 20 sinek) her kimyasal konsantrasyonun altı maruz kalma şişesine aktarın. Bu şişeleri “erkek” olarak etiketleyin. Adım 3.5’te açıklanan aynı aktarım yöntemini kullanın. Adım 3.7’den itibaren gece boyunca aç bırakılan sineklerin şişelerini kullanarak mavi boya içeren kimyasal maruz kalma şişelerini aşağıdaki gibi hazırlayın:Açlıktan ölen dişi sineklerin bir şişesini (şişe başına 20 sinek) her kimyasal konsantrasyon için bir mavi maruz kalma şişesine aktarın. Bu şişeyi “dişi” olarak etiketleyin. Adım 3.5’te açıklanan aynı aktarım yöntemini kullanın. Açlıktan ölen erkek sineklerin bir şişesini (şişe başına yirmi sinek) her kimyasal konsantrasyon için bir mavi maruz kalma şişesine aktarın. Bu şişeyi “erkek” olarak etiketleyin. Adım 3.5’te açıklanan aynı aktarım yöntemini kullanın. Transferden sonra her şişede bulunan sinek sayısını kaydedin. Normalde, 20 sineğin tümü bir gecede açlıktan ve transferden kurtulmalıdır, ancak transfer sırasında ölen veya kaçanların toplamdan çıkarılmasını sağlayın. Pozlama şişelerini yatay olarak yeni hazırlanmış nem odalarına yerleştirin (nem odası hazırlığı için adım 3.6’ya bakın). Odaları yaklaşık% 60 nem ve 12:12 saat ışık: karanlık döngüsüne sahip 25 ° C’lik bir inkübatöre yerleştirin. Maruz kalma şişelerini, kimyasal maruziyetin başlamasından 24 ve 48 saat sonra inceleyin. Her zaman noktasında her şişedeki ölü sineklerin sayısını sayın ve kaydedin. Mavi maruz kalma şişelerini, kimyasal maruziyetin başlamasından 24 saat sonra inceleyin. Beslenme davranışındaki değişiklikleri değerlendirmek için adım 6.6’da özetlenen yöntemi kullanın. Kirlenmiş tüm şişeleri, filtre kağıdını, flug’ları ve sinekleri uygun kimyasal atık kaplarına atın. Canlı sinekler şişelerde kalırsa, uygun atık kabına atmadan önce sinekleri öldürmek için şişeleri dondurun.NOT: Maruz kalma şişelerinin ve sineklerin bertarafı, deneyde analiz edilen kimyasal (lar) tarafından belirlenir. Her zaman kimyasal güvenlik bilgi formunda belirtilen kimyasal güvenlik prosedürlerini takip edin. 9. Bir doz-yanıt eğrisinin hesaplanması Verileri analiz etmek için Benchmark Dose Yazılımını (BMDS, sürüm 3.2; bakınız Malzeme Tablosu) veya diğer benzer yazılımları kullanın34. Aşağıda, BMDS yazılımını kullanan iş akışı açıklanmaktadır. BMDS’nin Veri sekmesine tıklayın ve yeni veri kümesi ekle’ye tıklayın. Veri kümesindeki örneklerin sayısını girin, ikilemli üzerine tıklayın ve ardından veri kümesi oluştur’a tıklayın. Her çoğaltmayı veri kümesine ayrı bir satır olarak girin. Oluşturulan tablonun ilk sütununa dozu, adım 8.3’ten önce ölen veya kaybedilenleri hariç tutan sineklerin başlangıç sayısını ikinci sütuna ve üçüncü sütunda kimyasal maruziyetten ölen sineklerin sayısını girin. BMDS’nin Ana sekmesine tıklayın. Model Türünü Seç menüsü için açılır oka tıklayın ve Dichotomous’a tıklayın. Veri Kümeleri tablosundaki adım 9.2’deki veri kümesi için etkinleştir’e tıklayın. MLE ve Alternatifler tablosunda analiz için istenen modeller için kutulara tıklayın.NOT: Öncelikle Frequentist Restricted Dichotomous Hill modeli kullanılmıştır. Analizi çalıştır’a tıklayın. Program, öldürücülük eğrilerini ve model (ler) le ilgili ek ayrıntıları içeren bir çıktı dosyası oluşturacaktır.

Representative Results

Sinek uzun zamandır sodyum arsenit (NaAsO2) toksisitesini 35,36,37,38 belirleme çalışmalarında bir model olarak hizmet etmiştir. Protokolün etkinliğini göstermek için, erkek ve dişi sinekler, bu sonuçları daha önceki çalışmalarla karşılaştırmak amacıyla NaAsO2’ye maruz bırakıldı. Yukarıda açıklanan metodolojiyi kullanarak, yetişkin Oregon-R (BDSC stok # 2057) erkek ve dişileri bir dizi NaAsO 2 konsantrasyonuna (0, 0.01, 0.02, 0.1, 0.2, 1 ve2 mM) maruz bırakıldı ve maruziyetin başlamasından 48 saat sonra öldürücülük için puanlandı (Şekil 1A, B). Bu ilk analizin amacı, NaAsO2 toksisitesinin daha kesin bir karakterizasyonuna izin verecek yaklaşık konsantrasyon aralığını tanımlamaktı. Sonraki deneylerde, NaAsO 2 doz-yanıt eğrisini daha kesin olarak tanımlayan konsantrasyonlar seçildi (0, 0.2, 0.5, 1, 1.5, 2,2.5, 3, 3.5 ve 5 mM) (Şekil 1C, D). Elde edilen analizin% 100 ölümcüllüğe neden olan çeşitli konsantrasyonları incelediğini unutmayın. Veriler, Çevre Koruma Ajansı’nın kamuya açık Benchmark Dose Yazılımı sürüm 3.2.0.125 kullanılarak analiz edilmiştir. Veriler “ikilemli” olarak modellendi ve sonraki analizler için Dichotomous Hill modeli kullanıldı. Bu modele dayanarak, NaAsO2 ile beslenen erkek sineklerin son LD10, LD 25 ve LD 50’si sırasıyla 0.30 mM,0.50 mM ve0.65 mM idi. Dişi sinekler için bu değerler, 0.30 mM’lik bir LD10, 0.65 mM’lik bir LD25 ve 0.90 mM’lik bir LD50 ile biraz daha yüksekti. Genel olarak, bu yöntem kullanılarak elde edilen değerler, Drosophila melanogaster35,36,37,38’de arsenik toksisitesi için daha önce bildirilenlere benzer, böylece metodolojiyi doğrular. Doz-yanıt eğrisini hesaplamak için kullanılan altı kopyaya ek olarak, erkek ve dişi sinekler de ışık mikroskobu kullanılarak sindirim sisteminde kolayca görülebilen% 1 FD &C mavisi içeren NaAsO2 maruz kalma çözeltileri ile beslendi. NaAsO 2 ile beslenen sineklerin bağırsağında mavi boyanın varlığına dayanarak, hem erkek hem de dişi sinekler, sıvı ortamda bulunan NaAsO 2 konsantrasyonundan bağımsız olarak, kimyasal maruziyetin başlamasından 24 saat sonra beslenmeye devam etti (Şekil 2). Bununla birlikte, yutulan gıdaların bazen kadınlar için 0.2 mM’nin ve erkekler için 0.5 mM’nin üzerindeki dozlarda yetersizleştiği gözlenmiştir (Şekil 2). Bu bulgular, yetersizliğin Drosophila’nın arsenik zehirlenmesine verdiği yanıtta önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Şekil 1: 48 saat boyunca NaAsO2 ile tedavi edilen erkek ve dişi Drosophila için doz-yanıt eğrileri. Tüm grafikler, Dichotomous Hill modeline dayanarak test edilen her NaAsO2 konsantrasyonundaki ölü sineklerin tahmini oranlarını göstermektedir. (A,B) Her bir sinek cinsiyetinin ölmeye başladığı doza yaklaşmak için çok çeşitli NaAsO2 konsantrasyonları test edildi. (A) erkek verileri, (B) ise kadın verilerini gösterir. N = 4 şişe, şişe başına 20 sinek. (C,D) Her sinek cinsiyetinin% 10,% 25 ve% 50’sinin öldüğü kesin dozları belirlemek için daha dar bir NaAsO2 konsantrasyonu aralığı test edildi. Bu dozlar her grafiğin sağında belirtilmiştir. (C) erkek verileri, (D) ise kadın verilerini gösterir. N = 6 şişe, şişe başına 20 sinek. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: 24 saat boyunca NaAsO2 ile tedavi edilen erkek ve dişi Drosophila’nın mavi boya tahlilinden elde edilen temsili sonuçlar. Mikrograflar, Sineklerin artan NaAsO2 konsantrasyonlarıyla beslendiğini göstermektedir. Satır (A) erkek sinekleri gösterir ve satır (B) dişi sinekleri gösterir, NaAsO2 konsantrasyonu soldan sağa doğru artar. Karın, düşük konsantrasyonlarda göğüs kafesinin yakınında az miktarda mavi gösterir, bu da maruz kalma ortamının bağırsağa girdiğini gösterir. Daha yüksek konsantrasyonlarda, mavi boya ağız çevresinde birikmeye başlar, bu da maruz kalma ortamının yetersizleştirildiğini gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm’dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Meyve sineği Drosophila melanogaster, NAM’lar 16,18,19,21 için güçlü bir sistem olarak ortaya çıkmaktadır. Sinek topluluğuna sunulan eşsiz genetik kaynaklardan, genomik ve metabolomikteki son gelişmelerle birleştiğinde, Drosophila’yı kullanan kimyasal güvenlik çalışmaları, bireysel bileşiklerin metabolizma, fizyoloji ve hücre sinyalizasyonuna müdahale ettiği moleküler mekanizmaları hızlı bir şekilde tanımlayabilmektedir (örneğin, bkz.39). Bu ucuz protokol, doz-yanıt eğrilerini hızlı bir şekilde tanımlamak ve daha sonra RNA-seq ve metabolomik analiz için örnekler üretmek üzere tasarlanmıştır. Dahası, bu esnek protokol herhangi bir genotiple kullanım için uyarlanabilir ve birçok kimyasal sınıfını barındırabilir.

Bu protokolün dikkate değer bir yönü, önceki bir çalışmaya dayanan kimyasal maruziyette kullanılan sıvı gıda seçimidir, ancak Drosophila 18,22’nin çoğu toksikolojik çalışması tarafından kullanılan katı ortamdan farklıdır. Bu spesifik sıvı ortam, sineklerin tutarlı bir şekilde beslenmesini sağlamak için sineklerin de bu protokolde beslendiği standart, katı BDSC ortamının besin içeriğini yansıtacak şekilde seçilmiştir. Sıvı besleme ortamının basitliğinin birçok avantajı vardır. Sıvı ortamın işlenmesi, eritilmesi ve yeniden katılaşması veya tozdan yeniden oluşturulması gereken katı gıdalardan daha kolaydır. Sıvı ortam ayrıca sistemin verimini arttırır, besleme ortamı boyunca eşit kimyasal dağılım sağlar ve tehlikeli bileşiklerle çalışmak için harcanan zamanı azaltır. Ek olarak, ortam ısıtılacak çözeltiler gerektirmez, bu da uçucu test bileşiklerinin test edilmesini kolaylaştırır. Son olarak, gıda çözeltisine dahil edilen nispeten az sayıda bileşen nedeniyle, test kimyasalı ve diğer diyet bileşenleri arasında istenmeyen yan reaksiyonlar en aza indirilir. Gıdada kullanılan maya da inaktiftir ve besleme ortamının reaktivitesini daha da sınırlar. Bununla birlikte, yöntemin gelişimsel veya larva toksisitesini test etmek için uygun olmadığını lütfen unutmayın.

Protokolde kullanılan bazı malzemeler, polipropilen yerine cam sinek şişeleri kullanmak gibi ikame edilebilir. Bununla birlikte, kullanılan malzemeler, reaktifler ve cam eşyaların temizlenmesinden kaynaklanabilecek kimyasal maruziyetler arasındaki istenmeyen kimyasal reaksiyonları önlemek için hem inert hem de tek kullanımlık olacak şekilde seçilmiştir.

Sıvı gıda kullanımı, gıda teslimatı için bir araç gerektirir. Selüloz asetat filtre kağıdı, esnekliği ve inert doğası nedeniyle bu amaçla seçilmiştir28. Diğer araştırmacılar benzer protokoller kullandılar, ancak hassas görev mendilleri veya cam elyaf filtre29,30 gibi diğer araçlarla birlikte. Selüloz asetat filtre kağıdı bu ihtiyaçlara uygundur, çünkü kağıt ve flakon duvarı arasında büyük boşluklar olmadan sinek şişelerinin dibine sığdırmak için ideal şekle kadar kesilebilen, sineklerin ortama veya aracın kendisine sıkışması nedeniyle ölümü önleyen inert bir araçtır.

Bu sistemin önemli bir sınırlaması, bir kimyasalın test edilebilir maksimum konsantrasyonunun kimyasalın çözünürlüğüne bağlı olmasıdır. Suda çözünmeyen bileşikler, ilgilenilen kimyasal ile ek veya sinerjik etkilere yol açabilecek ek bir çözücü gerektirir. Bu aynı zamanda, tüm organizmalarda istenen son noktaya ulaşmak için yeterince konsantre stok çözeltileri hazırlamanın mümkün olmadığı durumlar yaratabilir, bu nedenle elde edilen verilerin analizini sınırlayabilir31. Bunu ele almak için, düşük su çözünürlüğüne sahip kimyasallar, gıda çözeltisine% 0,5’e kadar dimetil sülfoksit eklenerek test edilebilir. Diğer çözücüler de kullanılabilir, ancak organizma üzerindeki çözücü etkilerini en aza indirirken çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmak için çözelti içinde kabul edilebilir maksimum çözücü konsantrasyonunu belirlemek için ilgili her çözücü için ek araştırmalara ihtiyaç vardır.

Drosophila’daki koku alma yanıtının kapsamlı karakterizasyonu, sineklerin toksik bileşikleri40,41 tüketmekten nasıl kaçındıklarını ve tedavi edilen ortamlarda beslenmenin azalmasına neden olduğunu açıklamıştır. Mavi boya testi, araştırmacıların deneysel kimyasalın her bir konsantrasyonuolan 42,43,44 ile beslenen sineklerin beslenme davranışlarını verimli bir şekilde taramalarına izin vererek bu fenomeni ele almaktadır. Sineklerin gastrointestinal sisteminde mavinin varlığı veya yokluğu, sineğin toksik içeren ortamı yiyip yemediğini gösterir. Sinek Sıvı-Gıda Etkileşim Sayacı45 gibi sinek besleme davranışlarını değerlendirmek için daha karmaşık yöntemler mevcut olsa da, bu kalitatif yöntem daha yüksek verimli tarama için daha uygundur.

Bu protokolün dikkate değer bir yönü, sinekleri transfer etmeye veya maruz kalma şişesine ek sıvı eklemeye gerek kalmadan 48 saatlik bir maruz kalma süresi için optimize edilmiş olmasıdır. Bir nem odası kullanmak ve odaları yüksek nemde tutulan bir inkübatöre yerleştirmek, besleme ortamını içeren filtre kağıdının bu süre zarfında kurumasını önledi. Protokol daha uzun maruz kalma süreleri için uyarlanabilir, ancak yöntem, filtre kağıdının kurumamasını ve kurumaya bağlı olarak çözelti konsantrasyonunda veya ölümcüllükte önemli değişikliklere neden olmamasını sağlamak için ayarlanmalıdır.

Son olarak, bu protokolün önemli bir özelliği, araştırmacıların in vivo kimyasal etki mekanizmalarını daha iyi anlamak için vahşi tip organizmalar üzerindeki bu ön çalışmaları genişletmek için Drosophila için çok çeşitli genetik araçları kullanmalarına izin veren genetik varyantları kolayca barındırabilmesidir. Bu bağlamda, yukarıda özetlenen protokol, Peterson ve Long tarafından daha önce tanımlanmış bir JoVE protokolünü tamamlamak için kolayca değiştirilebilir ve bu da vahşi yakalanan sineklerin toksikolojik analizine izin verir18.

Drosophila32,33,34,35,36’daki sodyum arsenitin toksisitesi üzerine yapılan çok çeşitli önceki çalışmalar nedeniyle, Oregon-R sinekleri, sistemimizin etkinliğini göstermek için bu bileşikle muamele edildi. Erkek sinekler 0.65 mM’lik bir LD50 sergiledi ve dişiler 0.90 mM’lik bir LD50 sergiledi. Bu, sodyum arsenit ile muamele edilmiş yetişkin Drosophila’nın önceki çalışmalarıyla uyumludur. Örneğin, Goldstein ve Babich37, sineklerin% 50’sinin (karışık cinsiyetler) 0.5 mM NaAsO2’ye 7 gün maruz kaldıktan sonra öldüğünü bulmuşlardır. Bu, şu anda gözlemlenenden biraz daha düşük bir doz olmasına rağmen, yöntemleri ile bu yöntem arasındaki farklılıklar (katı maruz kalma ortamının kullanımı, daha uzun bir zaman ölçeği ve karışık cinsiyetler dahil) muhtemelen bu farkı açıklamaktadır. Önemli olarak, her iki yöntem de genel olarak benzer LD50 değerleriyle sonuçlandı.

Bu protokolü kullanan deneylerden elde edilen gözlemler, sonraki davranışsal veya mekanik çalışmalar için genetik ve moleküler hedefler bulmak için kullanılabilir. Maruz kalma yöntemi, Drosophila’yı metabolomik ve proteomik örnekleme için tedavi etmek için de kullanılabilir, bu da bu protokolü büyüyen hassas toksikoloji alanına (hassas tıp alanı46’dan modellenmiştir) çok uygun hale getirir. Bu bağlamda, maruz kalan sinekler, sonraki genomik ve metabolomik analizler için 8. adımdan sonra toplanabilir. Adım 8’de toplanan örnekler daha sonra adım 3’ten başlayarak Li ve Tennessen47 tarafından açıklandığı gibi işlenebilir.

Nihayetinde, yukarıda açıklanan deneylerden elde edilen verilerin yanı sıra sonraki metabolomik ve proteomik veriler, türler arası karşılaştırmalarda ideal olarak kullanılacaktır. Daha öncebelirtildiği gibi 26, bu tür türler arası çalışmalar güçlüdür ve bireysel kimyasalların korunmuş biyolojik yollara nasıl müdahale ettiğini belirleyebilir. Bu nedenle, yukarıda açıklanan protokol, filumdaki bireysel toksik maddelere yanıt olarak evrimsel ortaklıkları bulmak ve kimyasal güvenlik düzenlemesini bilgilendirmeye yardımcı olmak için kullanılabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu protokolün test edilmesi ve optimizasyonu konusunda yardımcı oldukları için personelimize teşekkür ederiz: Ameya Belamkar, Marilyn Clark, Alexander Fitt, Emma Rose Gallant, Ethan Golditch, Matthew Lowe, Morgan Marsh, Kyle McClung, Andy Puga, Darcy Rose, Cameron Stockbridge ve Noelle Zolman. Ayrıca, protokolün amaçlarını belirlemeye yardımcı oldukları için Hassas Toksikoloji Grubu’ndan meslektaşlarımıza, özellikle de Maruz Kalma Grubu meslektaşlarımıza teşekkür ederiz.

Bu proje, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon programından 965406 No’lu Hibe Anlaşması kapsamında fon almıştır. Bu yayında sunulan çalışma ASPIS Kümesi’nin bir parçası olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çıktı yalnızca yazarların görüşlerini yansıtmaktadır ve Avrupa Birliği, burada yer alan bilgilerin herhangi bir şekilde kullanılmasından sorumlu tutulamaz. Bu yayın aynı zamanda Indiana Klinik ve Translasyonel Bilimler Enstitüsü’nün desteğiyle mümkün olmuştur ve kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi, Klinik ve Translasyonel Bilimler Ödülü’nden UL1TR002529 Numaralı Ödül ile finanse edilmektedir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Bu projenin bazı bölümleri, JRS ve PhyloTox konsorsiyumuna verilen Indiana Üniversitesi fonlarıyla desteklendi. JMH ve EMP, Bloomington Drosophila Stock Center’a P40OD018537 NIH ödülü ile desteklendi.

Materials

1.5 inch flower lever action craft punch Bira Craft HCP-115-024
15 mL Centrifuge Tubes  VWR 89039-666 High-Performance Centrifuge Tubes with Flat or Plug Caps, Polypropylene, 15 mL
2 ml Tubes  VWR 16466-044 Micro Centrifuge Tube with Flat Screw-Cap, conical bottom
5 ml Tubes  VWR  60818-576 Culture Tubes, Plastic, with Dual-Position Caps
50 mL Centrifuge Tubes  Corning  430290 50 mL polypropylene centrifuge tubes, conical bottom with plug seal cap
Benchmark Dose Software version 3.2 U.S. Environmental Protection Agency
Cardboard trays Genesee Scientific flystuff 32-122 trays and dividers for narrow vials 
CO2 gas pads Genesee Scientific flystuff 59-114 FlyStuff flypad, CO2 anesthetizing apparatus 
Combitips advanced, 50 mL Eppendorf  0030089693 Combitips advanced, Biopur, 50 mL, light gray, colorless tips
Cotton balls Genesee Scientific flystuff 51-101 Cotton balls, large, fits narrow vials 
Delicate task wipes Kimtech 34155 Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipes, 1 Ply / 8.2" x 4.39"
Drosophila Vial Plugs, Cellulose Acetate (aka, Flugs) VWR 89168-888 Wide
FD&C Blue No. 1 Spectrum Chemical FD110 CAS number 3844-45-9
Flies  BDSC Stock #2057  OregonR wildtype 
Gloves (nitrile) Kimtech 55082/55081/55083 Kimtech purple nitrile exam gloves, 5.9 mil, ambidextrous 9.5" 
Grade 1 CHR cellulose chromatography paper Cytvia 3001-917 Sheet, 46 x 57 cm
Mesh for humidity chamber
Multipette / Repeater (X) stream  Eppendorf  022460811 Repeater Xstream 
Plastic grate Plaskolite 18469 (from lowes) Plaskolite 24 in x 48 in 7.85 sq ft louvered ceiling light panels, cut down to fit in rubbermaid tubs
Plastic trays for glass vials Genesee Scientific flystuff 59-207 Narrow fly vial reload tray 
Polypropylene Drosophila Vial VWR 75813-156 Wide (28.5 mm)
Rubbermaid tubs Rubbermaid 3769017 (from Lowes) Rubbermaid Roughneck Tote 10 gallon 18" L x 12" W x 8 1/2" H
Sucrose ultra pure MP Biomedicals, Inc. 821721
Tube racks for wide-mouthed tubes Thermo scientific  5970-0230 Nalgene Unwire Test tube racks, for 30 mm tubes 
Water Purification System Millipore Milli-Q ZMQ560F01 Millipore Milli-Q Biocel Water Purifier 
Yeast extract Acros Organics 451120050 CAS number 84604-16-0
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. United States Occupational Safety and Health Administration. Construction industry: OSHA safety and health standards (29 CFR 1926/1910). United States Occupational Safety and Health Administration. , (2022).
  2. Chemical, Metals, Natural Toxins & Pesticides Guidance Documents & Regulations. United States Food & Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/chemical-metals-natural-toxins-pesticides-guidance-documents-regulations (2022)
  3. Drinking Water Contaminant Candidate List (CCL) and Regulatory Determination. United States Food & Drug Administration Available from: https://www.epa.gov/cci (2022)
  4. Administration Bottled Water/Carbonated Soft Drinks Guidance Documents & Regulatory Information. United States Food & Drug Administration Available from: https://www.fda.gov/food/guidance-documents-regulatory-information-topic-food-and-dietary-supplements/bottled-watercarbonated-soft-drinks-guidance-documents-regulatory-information (2022)
  5. United States Congress. Federal Food, Drug, and Cosmetic Act. United States Congress. 21, 301-392 (1934).
  6. Determining if a Cleaning Product is a Pesticide Under FIFRA. Environmental Protection Agency Available from: https://www.epa.gov/pesticide-registration/determining-if-cleaning-produt-pesticide-under-fifra (2022)
  7. United States Congress. Toxic Substances Control Act of 1976. H.R. 12440. Library of Congress, United States. , 1640-1707 (1976).
  8. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: a first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  9. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacological Reviews. 63 (2), 411-436 (2011).
  10. New Approach Methods Work Plan. United States Environmental Protection Agency Available from: https://www.epa.gov/system/files/documents/2021-11/nams-work-plan_11_15_21_508-tagged.pdf (2021)
  11. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  12. Mahony, C. Building confidence in non-animal methods: Practical examples of collaboration between regulators, researchers and industry. Computational Toxicology. 10, 78-80 (2019).
  13. Kavlock, R. J., et al. Accelerating the pace of chemical risk assessment. Chemical Research in Toxicology. 31 (5), 287-290 (2018).
  14. European Chemicals Agency. New Approach Methodologies in Regulatory Science, Proceedings of the Scientific Workshop. European Chemicals Agency. , (2016).
  15. Wambaugh, J. F., et al. New approach methodologies for exposure science. Current Opinion in Toxicology. 15, 76-92 (2019).
  16. Rand, M. D. Drosophotoxicology: The growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32 (1), 74-83 (2010).
  17. Ong, C., Yung, L. Y. L., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9 (3), 396-403 (2015).
  18. Peterson, E. K., Long, H. E. Experimental protocol for using Drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory. Journal of Visualized Experiments. (137), e57450 (2018).
  19. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental toxicity assays using the Drosophila model. Current Protocols in Toxicology. 59, 11-20 (2014).
  20. Misra, J. R., Horner, M. A., Lam, G., Thummel, C. S. Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila. Genes & Development. 25 (17), 1796-1806 (2011).
  21. Rocha, J. B. T. Drosophila melanogaster as a promising model organism in toxicological studies. Archives of Basic and Applied Medicine. 1 (1), 33-38 (2013).
  22. Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the drosophotoxicology model. Methods in Molecular Biology. 1965, 139-153 (2019).
  23. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  24. Chien, S., Reiter, L. T., Bier, E., Gribskov, M. Homophila: human disease gene cognates in Drosophila. Nucleic Acids Research. 30 (1), 149-151 (2002).
  25. Wangler, M. F., et al. Model organisms facilitate rare disease diagnosis and therapeutic research. 유전학. 207 (1), 9-27 (2017).
  26. Colbourne, J. K., et al. Toxicity by descent: A comparative approach for chemical hazard assessment. Environmental Advances. 9, 100287 (2022).
  27. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. 유전학. 201 (3), 815-842 (2015).
  28. Vang, L. L., Medvedev, A. V., Adler, J. Simple ways to measure behavioral responses of Drosophila to stimuli and use of these methods to characterize a novel mutant. PLoS One. 7 (5), 37495 (2012).
  29. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B., Byfield, F. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), e3795 (2012).
  30. Bloomington Drosophilia Stock Center. BDSC Cornmeal Food Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2022)
  31. Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a Smurf? – ageing and beyond… in vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio-Protocol. 8 (3), 2722 (2018).
  32. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
  33. Benchmark Dose Software (BMDS) (Build 3.3; Model Library Version 2022.10) [Computer Software]. United States Environmental Protection Agency Available from: https://www.epa.gov/bmds/download-bmds (2022)
  34. Ortiz, J. G., Opoka, R., Kane, D., Cartwright, I. L. Investigating arsenic susceptibility from a genetic perspective in Drosophila reveals a key role for glutathione synthetase. Toxicological Sciences. 107 (2), 416-426 (2009).
  35. Pickett, A. D., Patterson, N. A. Arsenates: effect on fecundity in some Diptera. Science. 140 (3566), 493-494 (1963).
  36. Goldstein, S. H., Babich, H. Differential effects of arsenite and arsenate to Drosophila melanogaster in a combined adult/developmental toxicity assay. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 42 (2), 276-282 (1989).
  37. Polak, M., Opoka, R., Cartwright, I. L. Response of fluctuating asymmetry to arsenic toxicity: support for the developmental selection hypothesis. Environmental Pollution. 118 (1), 1928 (1928).
  38. Zhou, S., et al. A Drosophila model for toxicogenomics: Genetic variation in susceptibility to heavy metal exposure. PLoS Genetics. 13 (7), 1006907 (2017).
  39. Anholt, R. R. H. Chemosensation and evolution of Drosophila host plant selection. iScience. 23 (1), 100799 (2020).
  40. Depetris-Chauvin, A., Galagovsky, D., Grosjean, Y. Chemicals and chemoreceptors: ecologically relevant signals driving behavior in Drosophila. Frontiers in Ecology and Evolution. 3, 41 (2015).
  41. Aryal, B., et al. Protocol for binary food choice assays using Drosophila melanogaster. STAR Protocols. 3 (2), 101410 (2022).
  42. Shimada, I., Nakao, M., Kawazoe, Y. Acute differential sensitivity and role of the central nervous system in the feeding behavior of Drosophila melanogaster. Chemical Senses. 12 (3), 481-490 (1987).
  43. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147 (4), 433-437 (1982).
  44. Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
  45. National Research Council. Toward Precision Medicine: Building a Knowledge Network for Biomedical Research and a New Taxonomy of Disease. National Academy of Sciences. , (2011).
  46. Li, H., Tennessen, J. M. Preparation of Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomics. Journal of Visualized Experiments. (136), e57847 (2018).

Tags

Drosophila MelanogasterChemical Toxicity AssessmentNAMsLiquid MediaFilter Paper InsertsStarvation VialsHumidity ChamberChemical Exposure VialsFemale FliesBlue Dye

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Holsopple, J. M., Smoot, S. R., Popodi, E. M., Colbourne, J. K., Shaw, J. R., Oliver, B., Kaufman, T. C., Tennessen, J. M. Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (193), e65029, doi:10.3791/65029 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image