Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Trotz Fortschritten in der Entwicklung von Medikamenten und der Forschung zur Malariaprävention und -behandlung ist die weltweite Krankheitslast durch Malaria nach wie vor hoch. Mehr als eine halbe Million Menschen sterben jedes Jahr an Malaria, wobei die höchste Sterblichkeitsrate bei Kindern beobachtet wird, die in Malaria-endemischen Regionen wie Afrika südlich der Sahara leben¹. Malaria wird durch den Parasiten Plasmodium verursacht, der durch den Stich weiblicher Anopheles-Mücken, die den Parasiten in ihren Speicheldrüsen tragen, auf den Menschen übertragen wird. Das infektiöse Stadium der Plasmodien – die Sporozoiten – lagern sich während einer Blutmahlzeit in der Haut der Wirbeltierwirte ab und wandern durch den Blutkreislauf, um Leberzellen zu infizieren, wo sie sich vor der Infektion der Erythrozyten obligatorisch entwickeln (prä-erythrozytäre Malaria). Die Infektion der Erythrozyten löst das Blutstadium der Malaria aus und ist für die Gesamtheit der mit der Krankheit verbundenen Morbidität und Mortalität verantwortlich ^2,3.

Die obligate Natur der präerythrozytären Entwicklung von Plasmodium hat es zu einem attraktiven Ziel für die prophylaktische Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten gemacht⁴. Eine Voraussetzung für die Erforschung der Biologie der präerythrozytären Malaria sowie für die Entwicklung von Impfstoffen oder Medikamenten, die auf das Leberstadium abzielen, ist der Zugang zu Plasmodium-Sporozoiten. Darüber hinaus war unsere Fähigkeit, genetisch veränderte Plasmodium-Sporozoiten zu erzeugen, maßgeblich für den Erfolg solcher Forschungsbemühungen 5,6,7,8,9. Transgene Plasmodiumlinien, die fluoreszierende oder lumineszierende Reporterproteine exprimieren, haben es uns ermöglicht, ihre Entwicklung in vivo und in vitro zu verfolgen ^10,11. Genetisch abgeschwächte Parasiten (GAPs), die durch die Deletion mehrerer Gene in Plasmodium erzeugt werden, gehören ebenfalls zu den vielversprechendsten Impfstoffkandidaten^12,13.

Malariamodelle von Nagetieren und nicht-menschlichen Primaten haben uns geholfen, die Mechanismen der Wirt-Parasiten-Interaktionen bei der menschlichen Malaria zu verstehen, da die Plasmodium-Arten Ähnlichkeiten in Biologie und Lebenszyklus aufweisen¹⁴. Die Verwendung von Plasmodium-Spezies, die Nagetiere, aber nicht den Menschen infizieren (z. B. P. berghei), ermöglicht die Aufrechterhaltung des gesamten Parasitenlebenszyklus und die Generierung infektiöser Sporozoiten für die Untersuchung von Malaria im Leberstadium in einer kontrollierten Umgebung der Biosicherheitsstufe 1. Für die Generierung von transgenen Plasmodium-Parasiten im Blutstadium¹⁵, die Infektion von Stechmücken¹⁶ und die Isolierung von Sporozoiten¹⁷ gibt es bereits eine Vielzahl separater Protokolle. In dieser Arbeit skizzieren wir ein umfassendes Protokoll, das diese Methoden kombiniert, um transgene P. berghei-Sporozoite am Beispiel des neuartigen transgenen Stammes PbGFP₁₁ zu generieren und zu isolieren. PbGFP 11 transportiert den 11. β-Strang des grün fluoreszierenden Super-Ordner-Proteins (GFP), GFP₁₁, in die parasitophore Vakuole (PV), die in den Wirtshepatozyten erzeugt wird. PbGFP₁₁ wird in Verbindung mit transgenen Hepatozyten (Hepa1-6-Hintergrund) verwendet, die Reste exprimieren, die das GFP 1-10-Fragment (GFP 1-10) im Zytoplasma bilden (Hepa-GFP-1-10-Zellen). PbGFP₁₁ berichtet über die PV-Lyse in den Wirtshepatozyten durch Selbstkomplementierung und die Neubildung von funktionellem GFP und dem grünen Fluoreszenzsignal¹⁸. Bemerkenswert ist, dass GFP 11 als eine Reihe von sieben Tandemsequenzen in PbGFP₁₁ kodiert ist, um das resultierende Fluoreszenzsignal zu verstärken. Durch die Färbung von PbGFP₁₁ Sporozoiten mit dem zytoplasmatischen Farbstoff CellTrace Violet (CTV) können wir die Parasiten verfolgen. Die Lyse solcher CTV-gefärbten intrazellulären Parasiten selbst führt zu einem Austritt von CTV in das Zytoplasma der Wirtszelle und zur Färbung der Wirtszelle. Neben der Visualisierung und Unterscheidung der Lyse von Plasmodium PV und/oder des Parasiten in Wirtshepatozyten kann dieses System zuverlässig verwendet werden, um die für einen dieser Prozesse verantwortlichen Immunwege durch die genetische oder therapeutische Störung der molekularen Komponenten solcher Signalwege zu untersuchen.