生成转基因 伯氏疟原 虫孢子

尽管在药物开发和疟疾预防和治疗研究方面取得了进展，但疟疾的全球疾病负担仍然很高。每年有五十多万人死于疟疾，其中生活在疟疾流行地区（如撒哈拉以^南非洲）的儿童死亡率最高1。疟疾是由寄生虫疟原虫引起的，疟原虫通过唾液腺中携带寄生虫的雌性按蚊叮咬传播给人类。疟原虫的感染阶段 – 子孢子 – 在血粉中沉积在脊椎动物宿主的皮肤中，并通过血液感染肝细胞，在感染红细胞之前，它们会经历强制性发育（构成红细胞前期疟疾）。红细胞感染启动了疟疾的血液阶段，并导致了与该疾病相关的全部发病率和死亡率 ^2,3。

疟原虫红细胞前发育的专性使其成为预防性疫苗和药物开发工作的有吸引力的靶标⁴.研究红细胞性疟疾前期的生物学以及开发针对肝脏阶段的疫苗或药物的先决条件是获得疟原虫孢子体。此外，我们产生转基因疟原虫孢子体的能力对此类研究工作的成功起到了重要^作用5,6,7,8,9。表达荧光或发光报告蛋白的转基因疟原虫系使我们能够跟踪它们在体内和体外的发育 ^10,11。通过疟原虫中多个基因的缺失而产生的遗传减毒寄生虫 （GAP） 也是一些最有希望的候选疫苗^12,13。

啮齿动物和非人类灵长类疟疾模型有助于我们了解人类疟疾中宿主-寄生虫相互作用的机制，因为疟原虫物种在生物学和生命周期方面具有相似性¹⁴.使用感染啮齿动物但不感染人类的疟原虫物种（例如，伯氏疟原虫）可以维持完整的寄生虫生命周期并产生传染性子孢子体，以便在受控的生物安全 1 级环境中研究肝期疟疾。对于转基因血液阶段疟原虫寄生虫^{的产生 15}、蚊子感染 16 和孢子体分离¹⁷，已经存在各种单独的方案。在这里，我们概述了一种结合这些方法的综合方案，以产生和分离转基因伯氏疟原虫子，以新型转基因菌株PbGFP₁₁为例。PbGFP 11 将超文件夹绿色荧光蛋白 （GFP） 的第 11 β链 GFP₁₁ 转运到宿主肝细胞中产生的寄生虫液泡 （PV） 中。PbGFP 11 与转基因肝细胞（Hepa1-6 背景）结合使用，这些转基因肝细胞表达在细胞质（Hepa GFP _1-10 细胞）中构成 GFP 1-10 片段 （GFP _1-10） 的残基。PbGFP₁₁ 通过自我互补和功能性 GFP 的重建以及绿色荧光信号¹⁸ 报道宿主肝细胞中的 PV 裂解。值得注意的是，GFP 11 在 PbGFP₁₁ 中被编码为一系列七个串联序列，以增强产生的荧光信号。用细胞质染料 CellTrace Violet （CTV） 对 PbGFP₁₁ 孢子体进行染色后，我们可以追踪寄生虫。这种CTV染色的细胞内寄生虫本身的裂解导致CTV泄漏到宿主细胞质中并对宿主细胞进行染色。除了可视化和区分宿主肝细胞中疟原虫PV和/或寄生虫的裂解外，该系统还可以可靠地用于研究负责这些过程的免疫途径，通过遗传或治疗扰动这些途径的分子成分。