TACI: תוסף ImageJ לניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) הוא תוסף קוד פתוח ImageJ לניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית הבוחן תנועה על ציר z ומזהה את הערך המרבי של כל ערימת z כדי לייצג את עוצמת התא בנקודת הזמן המתאימה. הוא יכול להפריד תאי עצב החופפים בכיוון הצידי (x/y) אך במישורי z שונים.
Abstract
המחקר במדעי המוח התפתח לשימוש בכלים מורכבים של הדמיה וחישוב כדי לחלץ מידע מקיף ממערכי נתונים. הדמיית סידן היא טכניקה נפוצה הדורשת תוכנה מתוחכמת כדי להשיג תוצאות אמינות, אך מעבדות רבות מתקשות לאמץ שיטות חישוביות בעת עדכון פרוטוקולים כדי לעמוד בתקנים מודרניים. קשיים מתעוררים עקב חוסר ידע בתכנות וחומות תשלום עבור תוכנה. בנוסף, תאים מעניינים מציגים תנועות לכל הכיוונים במהלך הדמיית סידן. גישות רבות פותחו כדי לתקן את התנועה בכיוון הצידי (x/y).
מאמר זה מתאר זרימת עבודה באמצעות תוסף ImageJ חדש, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), כדי לבחון תנועה על ציר z בדימות סידן תלת-ממדי. תוכנה זו מזהה את ערך הפלואורסצנטיות המרבי מכל מיקומי z שבהם תא עצב מופיע ומשתמשת בו כדי לייצג את עוצמת תא העצב במיקום t המתאים. לכן, הכלי הזה יכול להפריד תאי עצב החופפים בכיוון הצידי (x/y) אך מופיעים במישורי z נפרדים. כתוסף ImageJ, TACI הוא כלי חישובי ידידותי למשתמש בקוד פתוח לניתוח הדמיית סידן תלת-ממדית. תיקפנו את זרימת העבודה הזו באמצעות תאי עצב רגישים לחום של זחלי זבובים שהציגו תנועות לכל הכיוונים במהלך תנודות טמפרטורה ומערך נתונים תלת-ממדי של דימות סידן שנרכש ממוח הזבוב.
Introduction
רמת הסידן התוך-תאי היא סמן מדויק של עוררות עצבית. הדמיית סידן מודדת את השינויים בסידן התוך-תאי כדי להבין את הפעילות העצבית1. מחקרים במדעי המוח השתמשו יותר ויותר בשיטה זו בשל פיתוח טכניקות למדידת ריכוז סידן תוך תאי, כולל אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית (GECIs), כגון GCaMP2,3, אשר יכול לבוא לידי ביטוי לא פולשני בקבוצות ספציפיות של נוירונים באמצעות גישות גנטיות. העלויות הנמוכות יותר של לייזרים ורכיבי מיקרוסקופ הגדילו גם את השימוש בדימות סידן4. חשוב לציין, דימות סידן מאפשר להקליט ולחקור נוירונים בודדים, כמו גם אוכלוסיות נוירונים גדולות בו זמנית בבעלי חיים הנעים בחופשיות5.
אף על פי כן, הניתוח של נתוני דימות סידן הוא מאתגר מכיוון ש-(1) הוא כרוך במעקב אחר השינויים בפלואורסצנטיות של תאים בודדים לאורך זמן, (2) האות הפלואורסצנטי נעלם לסירוגין או מופיע שוב עם תגובות עצביות, ו-(3) הנוירונים עשויים לנוע לכל הכיוונים, במיוחד פנימה והחוצה ממישור מוקד או להופיע במספר מישורים4, 6. ניתוח ידני גוזל זמן והופך ללא מעשי ככל שאורך ההקלטות ומספר תאי העצב גדל. תוכנות שונות פותחו כדי להאיץ את תהליך ניתוח הדמיית הסידן. בעבר, התוכנה תוכננה בהקשר ניסיוני מוגבל, מה שהקשה על מעבדות אחרות לאמץ אותה. מאמצים אחרונים לעמוד בסטנדרטים מודרניים לשיתוף תוכנה הובילו לפיתוח מספר כלים שיכולים לנתח באופן עקבי נתוני דימות סידן בקבוצות שונות 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . עם זאת, רוב הכלים הללו דורשים ידע בתכנות ו/או תלויים בתוכנות מסחריות. מחסור בידע בתכנות וחומות תשלום בתוכנה מרתיעות חוקרים מלאמץ שיטות אלה. יתר על כן, רבים מהכלים הללו מתמקדים בתיקון תנועת x/y, אם כי גם תנועה על ציר z צריכה להיות מאובחנת ומתוקנת במפורש6. יש צורך בכלי חישובי לניתוח דימות סידן תלת-ממדי המתמקד בתאי עצב המציגים סחף Z ומופיעים במספר מישורי z. באופן אידיאלי, כלי זה צריך להשתמש בתוכנת קוד פתוח ולא לדרוש ידע בתכנות כדי לאפשר למעבדות אחרות לאמץ אותו בקלות.
כאן, פיתחנו תוסף ImageJ חדש, TACI, לניתוח נתוני הדמיה תלת ממדית של סידן. ראשית, התוכנה משנה את שמה, במידת הצורך, ומארגנת את נתוני הדמיית הסידן התלת-ממדית לפי מיקומי z. התאים המעניינים נמצאים במעקב בכל מיקום z, ועוצמות הפלואורסצנטיות שלהם מופקות על ידי TrackMate או כלים חישוביים אחרים. לאחר מכן מופעל TACI כדי לבחון את התנועה על ציר z. הוא מזהה את הערך המרבי של ערימת z ומשתמש בו כדי לייצג את עוצמת התא בנקודת הזמן המתאימה. תהליך עבודה זה מתאים לניתוח דימות סידן תלת-ממדי עם תנועה לכל הכיוונים ו/או עם תאי עצב החופפים בכיוון הצידי (x/y) אך מופיעים במיקומי z שונים. כדי לאמת את זרימת העבודה הזו, נעשה שימוש במערכי נתונים תלת-ממדיים של דימות סידן מתאי עצב רגישים לחום של זחלי זבובים ונוירונים של פטריות במוח. שימו לב, TACI הוא תוסף קוד פתוח ImageJ ואינו דורש ידע בתכנות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה פיתח תוסף חדש של ImageJ, TACI, ותיאר זרימת עבודה המנתחת הדמיית סידן תלת-ממדית. כלים רבים הזמינים כיום מתמקדים בתיקון תנועת x/y, אם כי גם תנועה על ציר z צריכה להיות מאובחנת במפורש או מתוקנת6. במהלך רכישת תמונה באורגניזם חי, תנועה על ציר z היא בלתי נמנעת גם כאשר האורגניזם משותק, וגי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Zeiss LSM 880 במרכז ההדמיה Fralin שימש לאיסוף נתוני הדמיית הסידן. אנו מודים לד”ר מישל ל. אולסן ויוהנג פאן על עזרתם בתוכנת IMARIS. אנו מודים לד”ר לנווד ס. הית’ על הערות בונות על כתב היד ולסטיבן ג’יאווסיס על הערות על קובץ ה-README של GitHub. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) ו- NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) ל- L.N. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתב היד.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
