O presente protocolo descreve as etapas de purificação e estudos subsequentes de quatro diferentes β-glucanos fúngicos como potenciais moléculas imunomoduladoras que aumentam as propriedades antitumorais da micróglia contra células de glioblastoma.
Um dos maiores desafios no desenvolvimento de terapias eficazes contra o glioblastoma é superar a forte supressão imunológica dentro do microambiente tumoral. A imunoterapia tem emergido como uma estratégia eficaz para transformar a resposta do sistema imune contra as células tumorais. Macrófagos e micróglias associados à glioma (MAGs) são os principais impulsionadores desses cenários anti-inflamatórios. Portanto, aumentar a resposta anticancerosa em MAGs pode representar uma terapia coadjuvante potencial para tratar pacientes com glioblastoma. Nessa linha, as moléculas fúngicas de β-glucano têm sido conhecidas há muito tempo como potentes moduladores imunológicos. Sua capacidade de estimular a atividade imune inata e melhorar a resposta ao tratamento tem sido descrita. Essas características moduladoras são parcialmente atribuídas à sua capacidade de se ligar a receptores de reconhecimento de padrões, que, curiosamente, são muito expressos em GAMs. Assim, este trabalho está focado no isolamento, purificação e subsequente uso de β-glucanas fúngicas para aumentar a resposta tumoricida da microglia contra células de glioblastoma. As linhagens celulares de glioblastoma de camundongo (GL261) e microglia (BV-2) são usadas para testar as propriedades imunomoduladoras de quatro diferentes β-glucanas fúngicas extraídas de cogumelos fortemente utilizados na indústria biofarmacêutica atual: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum. Para testar esses compostos, ensaios de co-estimulação foram realizados para medir o efeito de um meio pré-ativado condicionado por microglia sobre a proliferação e ativação da apoptose em células de glioblastoma.
Apesar do advento de novas conquistas no campo da neuro-oncologia, a expectativa de vida dos pacientes com glioblastoma permanece escassa. As terapias padrão-ouro contra tumores cerebrais são baseadas na fusão de cirurgia, radioterapia e quimioterapia. No entanto, na última década, a imunoterapia emergiu como uma poderosa estratégia para o tratamento de diferentes tipos decâncer1. Assim, a possibilidade de aproveitar a resposta imune do organismo contra as células tumorais tornou-se recentemente o quarto pilar da oncologia.
Há muito se sabe que um dos maiores desafios na área é superar a forte imunossupressão encontrada no microambientetumoral2. Particularmente, no caso do glioblastoma, uma das formas mais comuns e agressivas de câncer cerebral, desvendar caminhos-chave que orquestram tais cenários pró-tumorais e encontrar novos compostos que poderiam neutralizar a resposta depressiva do sistema imunológico pode abrir caminho para futuras terapias contra essa doença incurável.
O cérebro possui suas próprias células do sistema imunológico, e o tipo de célula mais relevante são a microglia. Comprovadamente, essas células têm um comportamento bastante complexo em diferentes doençascentrais3. No caso de tumores cerebrais primários (por exemplo, glioblastoma), essas células são deslocadas para um fenótipo anti-inflamatório que suporta as células tumorais para colonizar o parênquima cerebral3. Inúmeras publicações têm reforçado o papel importante dessas células durante a progressão tumoral. Uma das principais razões para isso é que a micróglia associada ao glioma e os macrófagos infiltrados (MAGs) respondem por um terço da massa tumoral total, sugerindo a influência inequívoca de seus estados de ativação durante a progressão do tumor cerebral 4,5.
Nesse sentido, os β-glucanos fúngicos têm sido descritos como moléculas potentes que desencadeiam respostas imunes efetivas, incluindo fagocitose e produção de fatores pró-inflamatórios, levando à eliminação de agentes perniciosos 6,7,8,9,10. Os β-glucanos fúngicos têm sido geralmente estudados usando extratos de diferentes partes do cogumelo. Entretanto, a atribuição de efeitos específicos requer sua purificação para evitar ambiguidades e poder compreender o mecanismo de ação de tais moléculas como agentes imunomoduladores8.
Neste trabalho, β-glucanas solúveis são purificadas do corpo frutífero de quatro diferentes cogumelos, regularmente empregados como cogumelos comestíveis (Pleurotus ostreatus e Pleurotus djamor) e medicinais (Ganoderma lucidum e Hericium erinaceus). Em particular, estes quatro cogumelos têm uma grande utilização na indústria alimentar e farmacêutica e foram produzidos no âmbito de uma economia circular ecológica numa empresa comercial (ver Tabela de Materiais).
A fim de estabelecer as bases para o uso futuro de β-glucanas fúngicas em terapias de câncer cerebral, estratégias de purificação bem definidas e estudos pré-clínicos que se aprofundam em sua interação putativa com células do sistema imunológico são essenciais para avaliar seu papel potencial como mediadores antitumorais. Este trabalho descreve as inúmeras etapas de isolamento e purificação necessárias para recuperar os β-glucanos solúveis contidos nos corpos frutíferos do cogumelo selecionado. Uma vez purificadas com sucesso, as células da microglia são ativadas para melhorar seu fenótipo inflamatório. Células de glioblastoma de camundongo (GL261) são revestidas com um meio diferente condicionado por microglia, previamente tratado com esses extratos, e então seu efeito sobre o comportamento das células tumorais é avaliado. Curiosamente, estudos piloto de nosso laboratório (dados não mostrados) descobriram como a microglia pró-inflamatória pode retardar a migração de células tumorais e as propriedades de invasão não apenas em células de glioblastoma, mas também em outras linhagens de células cancerosas. Este trabalho multidisciplinar pode fornecer uma ferramenta útil para pesquisadores de oncologia testarem compostos promissores capazes de aumentar a resposta imune em muitos tipos diferentes de tumores.
Este trabalho descreve o uso de técnicas bem estabelecidas para isolar, purificar e caracterizar com sucesso o conteúdo de SβGs de quatro fungos diferentes. Os resultados mostraram como após a extração em água quente das SMPs, obtidas de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus, seguida de tratamento hidrolítico com α-amilase, glucosidase e protease, os teores de α-glucana e proteína foram reduzidos, enriquecendo significativamente a quantidade de SβGs puros.
…The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer à Dra. Vasiliki Economopoulos por seu script interno para medir o sinal de fuluorescência no ImageJ. Gostaríamos também de agradecer ao CITIUS (Universidade de Sevilha) e a todo o seu pessoal pelo apoio durante a manifestação. Este trabalho foi apoiado pelo espanhol FEDER I + D + i-USE, US-1264152 da Universidade de Sevilha, e pelo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
H2SO4 | |||
HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |