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의학

Controllo meccanico del rilassamento mediante trabecole cardiache intatte

Published: February 17, 2023
doi:
10.3791/64879
, , ,
1Department of Physiology,Wayne State University, 2School of Medicine, Michigan State University-Macomb and Department of Physiology,Wayne State University

Summary

Un rapido rilassamento miocardico e cardiaco è essenziale per la normale fisiologia. I meccanismi di rilassamento meccanico sono ora noti per dipendere dalla velocità di deformazione. Questo protocollo fornisce una panoramica dell’acquisizione e dell’analisi degli esperimenti per studiare ulteriormente il controllo meccanico del rilassamento.

Abstract

La disfunzione diastolica è un fenotipo comune nelle presentazioni delle malattie cardiovascolari. Oltre all’elevata rigidità cardiaca (elevata pressione ventricolare sinistra end-diastolica), il rilassamento cardiaco alterato è un indicatore diagnostico chiave della disfunzione diastolica. Mentre il rilassamento richiede la rimozione del calcio citosolico e la disattivazione dei filamenti sottili sarcomerici, il targeting di tali meccanismi deve ancora fornire trattamenti efficaci. I meccanismi meccanici, come la pressione sanguigna (cioè il postcarico), sono stati teorizzati per modificare il rilassamento. Recentemente, abbiamo dimostrato che modificare la velocità di deformazione di uno stiramento, non il postcarico, era sia necessario che sufficiente per modificare il successivo tasso di rilassamento del tessuto miocardico. La dipendenza dal rilassamento dalla velocità di deformazione, chiamata controllo meccanico del rilassamento (MCR), può essere valutata utilizzando trabecole cardiache intatte. Questo protocollo descrive la preparazione di un piccolo modello animale, il sistema sperimentale e la camera, l’isolamento del cuore e il successivo isolamento di una trabecola, la preparazione della camera sperimentale e i protocolli sperimentali e di analisi. L’evidenza dell’allungamento dei ceppi nel cuore intatto suggerisce che MCR potrebbe fornire nuove arene per una migliore caratterizzazione dei trattamenti farmacologici, insieme a un metodo per valutare la cinetica del miofilamento nei muscoli intatti. Pertanto, lo studio del MCR può chiarire un percorso verso nuovi approcci e nuove frontiere nel trattamento dell’insufficienza cardiaca.

Introduction

Il rilassamento cardiaco è compromesso in quasi tutte le forme di insufficienza cardiaca (compresa l’insufficienza cardiaca con ridotta frazione di eiezione) e in molte malattie cardiovascolari. Oltre a numerosi metodi per valutare la funzione cardiaca nei muscoli permeabilizzati, la valutazione dei muscoli cardiaci intatti sta guadagnando interesse. Tali tessuti vengono valutati scaricati (estremità libere di contrarsi) o caricati (lunghezza o forza controllata). Storicamente, miociti isolati intatti sono stati valutati in una condizione di scarico, in cui il corpo cellulare è libero di accorciarsi durante la contrazione. Le trabecole cardiache intatte vengono spesso valutate in condizioni isometriche, in cui la lunghezza non può cambiare, ma viene generato stress (forza per area della sezione trasversale). Entrambi i metodi di miociti e trabecole intatti stanno iniziando a convergere con modifiche del carico 1,2.

I protocolli per il load-clamping di un muscolo (cioè il controllo dello stress sviluppato di un muscolo ad un valore specificato che simula i postcarichi fisiologici) sono stati sviluppati nel corso di diversi decenni 3,4,5. Nei tessuti cardiaci intatti, i morsetti di carico consentono ai ricercatori di imitare più da vicino il ciclo cardiaco in vivo utilizzando postcarichi isotonici o simili a Windkessel 6,7,8,9. L’obiettivo di questo protocollo è quello di ottenere dati utilizzati per quantificare il MCR (cioè la dipendenza dalla velocità di deformazione della velocità di rilassamento)8,9.

Mentre il protocollo MCR è stato adattato dal lavoro precedente, l’attenzione di questo protocollo (rispetto a protocolli simili che utilizzano tessuti cardiaci intatti) è sui meccanismi biomeccanici che modificano il rilassamento. Esistono diversi protocolli che utilizzano il load-clamping 3,4,5,7,10 e protocolli incentrati sui modelli Windkessel 1,2,11, ma questo protocollo descrive specificamente come l’allungamento prima del rilassamento modifica il tasso di rilassamento. Abbiamo dimostrato che questo controllo avviene durante un periodo proto-diastolico8, una fase originariamente descritta da Wiggers12. Nei cuori sani normali, il miocardio subisce uno sforzo di allungamento durante l’espulsione prima della chiusura della valvola aortica (cioè prima del rilassamento isovolumetico)13. Questo viene imitato prolungando la durata del controllo post-carico fino a quando il muscolo inizia ad allungarsi. L’evidenza clinica suggerisce che questo allungamento può essere attenuato o perso negli stati di malattia14, e le implicazioni e i meccanismi di alterazione dei tassi di deformazione end-sistolica non sono stati completamente chiariti. Date le scarse opzioni di trattamento per le malattie diastoliche e l’insufficienza cardiaca con una frazione di eiezione preservata, ipotizziamo che MCR possa fornire informazioni sui nuovi meccanismi alla base del rilassamento alterato.

Mentre la dissezione grossolana qui descritta si concentra sui roditori, l’isolamento della trabecola può essere eseguito da qualsiasi cuore intatto ed è stato precedentemente utilizzato con una trabecola cardiaca umana8. Allo stesso modo, l’acquisizione e l’analisi dei dati possono essere applicate anche ai cardiomiociti o ad altri tipi muscolari isolati 1,10. La discussione include commenti su possibili alterazioni e adattamenti al metodo, insieme a limitazioni, come la cautela contro l’utilizzo di muscoli papillari a causa delle proprietà meccaniche delle corde9.

Protocol

Il seguente protocollo è stato approvato dall’Institutional Animal Care and Use Committee della Wayne State University. Il protocollo qui descrive i passaggi per l’utilizzo di soggetti sperimentali sui roditori, ma può essere adattato per l’uso in altri organismi modello. 1. Preparazione Ottenere il soggetto sperimentale e permettergli di acclimatarsi al laboratorio. Preparare 250 mL di soluzione di perfusione e 250 mL di soluzione di Tyrode modificata (Tabella 1), ossigenando ciascuno a 10-20 ppm di O2, con pH 7,3. Preparare una siringa da 5 mL con una cannula attaccata. Riempire la siringa con soluzione di perfusione. Utilizzare cannule che sono 23 G per un topo e 18 o 16 G per un ratto piccolo o grande, rispettivamente. Far scorrere un tubo di polietilene (PE) lungo 1 mm sull’estremità di un ago smussato (Table of Materials), per evitare che l’aorta scivoli dalla cannula dopo essere stata legata. Preparazione completa dell’area di dissezione e incannulamento (Figura 1)Riempire due barche di pesatura pulita almeno a metà strada con soluzione di perfusione. Immergere la punta della cannula in soluzione di perfusione con almeno una sutura a doppio anello posizionata attorno alla cannula. Tenere la siringa in posizione con un morsetto a barra. Posizionare le forbici chirurgiche, un emostato, una pinza dell’iride, un paio di piccole forbici curve e due pinze # 3 per un facile accesso. Preparare il sistema sperimentale (Figura 2) innescando e facendo circolare la soluzione di Tyrode modificata in tutto il sistema sperimentale. Assicurarsi che la camera sia completamente piena e stabile. Accendere tutte le caselle di acquisizione dati, inclusi il trasduttore di forza, il motore di lunghezza, il sistema di stimolazione, il sistema di controllo della temperatura e il computer di acquisizione dati. Copiare e rinominare una cartella modello contenente i file *.dap e puntatore necessari per fare riferimento all’esperimento corrente. Aprire il software di acquisizione dati. Preparare gli strumenti di isolamento della trabecola (forbici Vannas, pinza #5 o #55, sonda di vetro) immergendo le loro punte in albumina sierica bovina (BSA) al 10% (p/v) in acqua ultrapura o soluzione di perfusione, per rivestire il metallo con proteine (Figura 2B).NOTA: L’intero sistema sperimentale deve essere preparato prima della dissezione. 2. Dissezione e incannulamento grossolani Registrare l’identificazione, il peso corporeo e altre informazioni pertinenti del soggetto animale. Facoltativamente, iniettare 1.000 U / kg di eparina in soluzione salina sterile al roditore tramite iniezione intraperitoneale almeno 10 minuti prima dell’eutanasia, per ridurre al minimo i rischi di coagulazione prima della perfusione coronarica. Porre l’animale in una camera di induzione e indurre l’anestesia generale utilizzando isoflurano al 3% -5% vaporizzato in ossigeno al 100%, secondo la procedura standard.NOTA: accendere eventuali scavenger esterni, tavoli da tiraggio o cappe aspiranti utilizzate per ridurre al minimo l’esposizione all’isoflurano. Una volta che il roditore perde il suo riflesso raddrizzante e la frequenza respiratoria è rallentata:(Per un ratto) rimuovere l’animale dalla camera di induzione e posizionarlo supino su un tampone di dissezione, con anestesia continua attraverso un cono nasale. (Per un topo) eseguire la dislocazione cervicale immediatamente dopo aver rimosso l’animale dalla camera di induzione. Il cono del naso non è necessario. Portare il vaporizzatore isoflurano allo 0%. Se necessario, fissare gli arti superiori del roditore al tampone di dissezione lontano dalla parete toracica usando del nastro adesivo sostenuto da spilli, facendo attenzione a non perforare l’animale. Verificare la corretta profondità dell’anestesia (mancanza di risposta del pizzico del piede) prima di procedere alla dissezione. Usando le forbici chirurgiche (Mayo per i ratti, Metzenbaum per i topi), appena sotto il processo xyphoid, tagliare la pelle trasversalmente su tutta la larghezza dell’addome del roditore nello spazio peritoneale. Usando le forbici chirurgiche, effettuare due tagli verticali parasagittali (fino ai lati della parete toracica) su entrambi i lati sinistro e destro della parete toracica dal taglio trasversale. Quindi, tagliare attraverso il diaframma, collegando i tagli parasagittali e liberando lo spazio toracico. Bloccare e sollevare il processo xyphoid usando un emostatico verso la testa del roditore, per spostare lo sterno e la parete toracica verso la testa del roditore, esponendo lo spazio toracico e il cuore. Se necessario, estendere rapidamente i tagli parasagittali vicino al secondo spazio vertebrale, per esporre completamente il cuore e / o rompere la membrana pericardica. Usando una pinza dell’iride curva, sollevare con attenzione il cuore per visualizzare i grandi vasi. Posizionare la pinza tra il miocardio e la colonna vertebrale del roditore, bloccare i vasi maggiori e sollevare il cuore, facendo attenzione a non bloccare gli atri o i segmenti ventricolari.Mentre si solleva leggermente il cuore, posizionare rapidamente le forbici dell’iride curve (concave verso l’alto) tra la pinza dell’iride curva e la colonna vertebrale del roditore e tagliare i grandi vasi e polmoni lontano dal cuore. Spostare rapidamente il cuore in una barca di pesatura o in un becher contenente una soluzione di perfusione fresca e agitare per aiutare a eliminare il sangue dal cuore. Portare il vaporizzatore isoflurano allo 0%, se non è già stato fatto. Se ampi segmenti di polmone, pericardico o altri tessuti rimangono attaccati al cuore, tagliarli con cura e scartarli in questo momento per ridurre al minimo l’interferenza con l’incannulamento. Utilizzando la pinza dell’iride curva, spostare il cuore in una barca o becher pulito, con la cannula preparata sommersa. Cannulare l’aorta, fissare l’aorta stringendo la sutura di seta ad anello e sciacquare con un massimo di 5 ml di soluzione di perfusione. Rimuovere il cuore dalla cannula e metterlo in una piastra di pesatura rivestita di elastomero siliconico per preparare l’isolamento della trabecola. 3. Isolamento ed equilibrazione della trabecola Posizionare il cuore nel piatto rivestito di elastomero siliconico sotto uno stereomicroscopio e illuminarlo. Individuare il tratto di efflusso ventricolare destro. Appuntare l’atrio sinistro e l’apice ventricolare all’elastomero siliconico nel piatto. Usando lunghe forbici Vannas, tagliare dal tratto di efflusso ventricolare destro all’apice lungo il setto. Tagliare dal tratto di efflusso ventricolare destro all’atrio destro vicino all’aorta, quindi tagliare attraverso l’atrio destro (Figura 3B). Usando una pinza, aprire con attenzione la parete libera del ventricolo destro (RV) dal tratto di deflusso, facendo attenzione a non allungare il tessuto.NOTA: Gli sperimentatori possono trovare sottili fili di tessuto connettivo bianco, che possono essere tagliati senza preoccupazioni. I fili più grandi, rosa (tessuto) devono essere valutati con cura, in quanto possono essere trabecole che possono essere isolate. Appuntare la parete libera del triangolo del ventricolo destro al piatto, per esporre il ventricolo destro (Figura 3C). Utilizzando una pipetta di vetro che è stata fusa e formata con un’estremità sottile (<500 μm di diametro) ma non affilata, cercare trabecole indipendenti nell'endocardio esposto (Figura 3C).NOTA: Una trabecola indipendente è una striscia di muscolo che si può sondare completamente sotto. Utilizzare trabecole che hanno lati paralleli (larghezza costante), evitando i muscoli papillari triangolari. Fare attenzione durante questo processo e la successiva dissezione, poiché l’applicazione di sforzo sulla trabecola può causare danni, riducendo la forza sviluppata. Sezionare la trabecola usando piccole forbici Vannas. Lasciare un pezzo di tessuto cubettato di ≥1 mm a ciascuna estremità della trabecola per consentire l’attaccamento. Non allungare la trabecola ove possibile e ridurre al minimo il contatto con strumenti metallici, poiché entrambi possono anche causare danni al muscolo. Riposizionare i perni che tengono il cuore secondo necessità per ridurre al minimo lo sforzo sul muscolo vicino alle trabecole identificate. Tagliare ~ 2 pollici dall’estremità di una pipetta di trasferimento da 7 ml, aspirare lentamente la trabecola nella pipetta e trasferirla in un nuovo piatto di pesatura contenente una soluzione di perfusione al 50% e una soluzione di Tyrode modificata al 50%. Lasciare che il muscolo si equilibri all’aumento del calcio extracellulare all’interno della soluzione miscelata per diversi minuti.Ripetere i passaggi 3.7-3.8 per sezionare trabecula aggiuntiva in questo momento, per ottenere trabecula aggiuntiva come backup. Spegnere la pompa che fornisce superfusione e/o aspirazione alla camera sperimentale. Utilizzando la pipetta di trasferimento a foro grande, spostare la trabecola nella camera sperimentale riempita con la soluzione di Tyrode. Appuntare un pezzo di tessuto cubo da >1 mm all’estremità della trabecola su un gancio sul trasduttore di forza, quindi fissare il secondo cubo al motore.NOTA: Separare il motore e il trasduttore di forza quando si monta il primo lato per un migliore accesso al trasduttore, quindi spostare i ganci il più vicino possibile quando si monta il secondo cubo di tessuto mentre la trabecola rimane allentata. Riavvia la superfusione e inizia a stimolare il muscolo per determinare la tensione di soglia. Andatura al 20% sopra la tensione di soglia per circa 1 ora per consentire alla trabecola di equilibrarsi. Alla fine di questo periodo di equilibrio, allungare lentamente il muscolo utilizzando il micrometro collegato al motore fino a raggiungere una generazione ottimale di stress sviluppato, osservando la tensione sviluppata (dal minimo al picco). Smettere di aumentare la lunghezza del muscolo quando la tensione diastolica passiva aumenta più velocemente della tensione di picco, indicando che la lunghezza ottimale è stata superata. Spegnere l’illuminazione del microscopio trasmesso e illuminare la trabecola usando un illuminatore a collo d’oca con un angolo ripido. Utilizzando una fotocamera collegata attraverso l’ottica del microscopio che è stata precedentemente calibrata, catturare un’immagine della trabecola durante la diastole nella cartella sperimentale. Se la trabecola è più ampia del campo visivo della fotocamera, scatta più immagini attraverso il muscolo. Aprire le immagini in un software di imaging che segnala le distanze dei pixel.Misurare la distanza dei pixel del diametro muscolare quattro volte lungo la sua lunghezza. Misurare la lunghezza del muscolo (trabecula) in pixel, escludendo il grande cubo di tessuto. Se la lunghezza del muscolo è più lunga del campo visivo, utilizzare i punti di riferimento lungo il muscolo per misurare l’intera lunghezza. Utilizzando il modello nella cartella sperimentale, calcolare la media delle misure di diametro e convertire il diametro e le lunghezze da pixel a mm utilizzando una calibrazione ottenuta in precedenza. Calcola l’area della sezione trasversale come π*diametro 2/4 in mm2 e la lunghezza del muscolo in μm. 4. Acquisizione dei dati Una volta che il muscolo è equilibrato, aprire il software di acquisizione dati, selezionare Esperimenti | Controllo lunghezza (Length Control), quindi immettere la lunghezza della trabecola calibrata (FL) e l’area della sezione trasversale (area [m2]) nella casella Taratura (Calibration). Dalla cartella del modello (passaggio 1.7), assicurarsi che il freeform_file.txt punti alla cartella corretta e aprire il file freeform.dap in un editor di testo. Impostare il livello isotonico (isoton) su 32.000 nel file *.dap. Nella casella Controllo lunghezza selezionare la scheda Forma libera e individuare il file di elenco Forma libera appropriato. Assicurarsi che il percorso di archiviazione dei dati sia anche la cartella corretta per salvare i dati. Iniziare ad acquisire dati da contrazioni completamente isometriche premendo Run Experiment, prima di acquisire i dati del load-clamp utilizzando un controllo di feedback con parametri di guadagno proporzionale e di integrazione. Acquisire i dati bloccati dal carico definendo l’afterload (isoton) nel file *.dap e iterare i valori dei parametri di guadagno proporzionale (propgain) e integrazione (Ki) salvando il file nell’editor di testo. Premere Esegui esperimento nell’interfaccia del software di acquisizione dati.Assicurarsi che il morsetto includa il riallungamento alla sua lunghezza originale (a volte indicato come carico di rilassamento5) durante questa iterazione per raggiungere l’intervallo massimo di velocità di deformazione, impostando la modalità (flswitch) da uno e aumentando la soglia per terminare il morsetto di carico (flthreshold) da zero. Controllare l’estremità del morsetto di carico modificando la modalità (flswitch) da uno a zero. Ripetere l’acquisizione mentre si modifica l’estremità del morsetto di carico da zero riallungamento a completo allungamento alla lunghezza iniziale.Per aumentare la lunghezza, aumentare in modo incrementale la soglia per terminare il morsetto di carico (flthreshold) da zero fino a quando il muscolo si allunga quasi alla sua lunghezza originale. Reimpostare la modalità (flswitch = 1) e la soglia (flthreshold = 0) ed eseguire un’ultima acquisizione dati. Se lo si desidera, modificare il postcarico nello studio ripetendo i passaggi 4.4-4.6. Questa acquisizione può essere effettuata immediatamente. Se lo si desidera, modificare il precarico allungando o accorciando il muscolo, o trattare il muscolo aggiungendo composti alla soluzione di Tyrode. Se si modifica il precarico o si aggiungono composti, attendere almeno 20 minuti per assicurarsi che la risposta a forza lenta 9,15 si sia stabilizzata e/o che il composto penetri completamente nel muscolo. Una volta completata l’acquisizione dei dati, rimuovere la trabecula. Se necessario, congelare o fissare la trabecola per analisi biochimiche o istologiche. Pulire le aree di lavoro e il sistema sperimentale, sciacquare tutti i tubi con acqua e spegnere tutti i componenti. 5. Analisi dei dati Aprire i file di dati utilizzando un programma di analisi quantitativa indirizzando il programma al percorso di file appropriato. Quantificare il rilassamento assicurando che il programma di analisi dei dati analizzi il battito bloccato e che il programma acquisisca correttamente l’inizio del morsetto di carico.Assicurarsi che l’estremità del morsetto di carico sia identificata, in modo che la velocità di rilassamento (1/τ) sia quantificata dalla derivata negativa di picco della sollecitazione durante un rilassamento isometrico. Utilizzare il metodo di Glantz16 per determinare questa costante di tempo esponenziale, o altra quantificazione appropriata del rilassamento (derivata minima dello stress, costante di tempo logistica 17 o modello cinematico18). Assicurarsi che il programma di analisi dei dati calcoli la velocità di deformazione prendendo la derivata temporale della deformazione, dove la deformazione viene calcolata come lunghezza in funzione del tempo diviso per la lunghezza alla contrazione ottimale. Ripetere i passaggi precedenti per tutte le tracce di una determinata condizione. Tracciare la relazione tra la velocità di rilassamento e la velocità di deformazione, limitando i dati massimi a una velocità di deformazione fisiologica inferiore a 1 s-1. Escludere i dati a basse velocità di deformazione (Figura 4C), poiché la fase di rilassamento potrebbe non riflettere il decadimento esponenziale17,18. Ottenere la pendenza della linea tra la velocità di rilassamento e la velocità di deformazione e registrare la pendenza come indice di MCR. Ripetere l’analisi precedente per ogni condizione interrogata.

Representative Results

Un set di dati rappresentativo è mostrato nella Figura 4 e ulteriori risultati possono essere trovati nelle pubblicazioni precedenti 8,9. In breve, la velocità di deformazione viene calcolata dalla derivata della deformazione, appena prima del rilassamento isometrico. La tensione è la lunghezza in funzione del tempo divisa per la lunghezza del muscolo alla lunghezza ottimale. Il tasso di rilassamento è calcolato come 1/τ, dove τ è la costante di tempo esponenziale16. Le velocità di deformazione multiple e le loro velocità di rilassamento risultanti sono necessarie per determinare il controllo meccanico del rilassamento (MCR). Questi dati sono tracciati su un grafico del tasso di rilassamento rispetto al tasso di deformazione. La pendenza della linea fornisce l’indice MCR. Si noti che i tassi di deformazione sistolica e diastolica finale non sono suscettibili di superare 1 s-1. Pertanto, la pendenza dovrebbe includere solo velocità di deformazione < 1 s-1. Il tasso di rilassamento a basse velocità di deformazione può essere confuso da variazioni nella derivata minima del tempo di stress (dStress / dtmin), e in questi casi, i dati di allungamenti inferiori a circa 0,15 s-1 possono essere ignorati. Figura 1: Impostazione della dissezione grossolana e dell’area di incannulamento cardiaco. Da destra a sinistra: a. La camera di induzione per anestesia per l’animale si trova vicino all’area di dissezione. b. Un boccaglio per scavenger di gas volatili opzionale. c. Un tampone di dissezione, dove l’animale sarà posto supino, è affiancato da (in senso orario) d. un naso, per fornire un’anestesia continua al roditore, e. emostatici, f. forbici chirurgiche, g. forbici sottili curve posizionate per un facile accesso con la mano dominante (tagliente), h. pinza dell’iride curva posizionata per un facile accesso con la mano non dominante. Gli arti superiori del roditore possono essere fissati al tampone di dissezione usando del nastro adesivo, e i. Un piatto di dissezione (o piccolo becher ) con soluzione di perfusione deve essere posizionato nelle vicinanze per sciacquare il cuore. j. Un’area predisposta per l’incannulamento deve essere posizionata nelle vicinanze. Una siringa con una cannula appropriata è montata su un supporto ad anello. k. (Riquadro) Un’immagine più ravvicinata di una cannula da 16 G, con 1 mm di tubo PE205 attaccato e una sutura annodata liberamente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Area sperimentale e strumenti. (A) Area sperimentale. La camera sperimentale e il sistema di acquisizione dati sono preparati su un microscopio invertito nelle vicinanze (a sinistra). L’isolamento e il montaggio della trabecola avvengono sotto uno stereoscopio (a destra). (B) Le punte di due pinze, le forbici Vannas grandi e piccole e una sonda di vetro personalizzata vengono preparate immergendo in una soluzione BSA al 10%. (C) Strumenti di dissezione aggiuntivi. Un piatto placcato in elastomero siliconico consente di montare il cuore durante la dissezione fine. Una pipetta di trasferimento da 7 mL con il taglio finale è mostrata sotto il piatto e la sonda di vetro. La punta tagliata della pipetta di trasferimento viene scartata e viene utilizzato un foro allargato per trasferire il muscolo, con un rischio minimo di allungamento o disidratazione. (D) Immagine ingrandita dell’estremità di una pipetta di vetro, lunga circa 2 mm e con un diametro di 0,25-0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Guida alla dissezione. (A) La dissezione grossolana dovrebbe iniziare con un taglio trasversale (1. verde) attraverso la pelle nella cavità peritoneale sotto il processo xifoideo (le costole inferiori e lo xifoide sono indicati da una sottile linea grigia). I tagli parasagittali dalla cavità peritoneale fino alla gabbia toracica dovrebbero seguire (2. verde acqua e 3. linee blu), dopo di che il diaframma dovrebbe essere tagliato. Un emostato può quindi essere utilizzato per bloccare il processo xyphoid ed elevare la parete toracica verso la testa. (B) Un cuore di ratto intatto appuntato su una capsula di elastomero di silicio, orientato con una vista del tratto di efflusso ventricolare destro (RVOT), dell’atrio destro (RA), dell’aorta (Ao) e dell’atrio sinistro (LA). La prima serie di tagli dovrebbe essere dal RVOT all’apice lungo il setto (1. Linea gialla). Una seconda serie di tagli dovrebbe essere dal RVOT lungo la base del cuore poi attraverso l’atrio destro (2. linea arancione). (C) L’RVOT può essere accuratamente allontanato dall’aorta per aprire il cuore e bloccarlo indietro. Le linee gialle e arancioni corrispondono ai tagli descritti in B. Le trabecole autoportanti si trovano spesso vicino alla base del muro libero del camper e vicino al setto, ma possono verificarsi ovunque (le linee rosse indicano posizioni comuni). (D) Vista ingrandita della sonda di vetro sotto una trabecola (la freccia gialla indica l’intersezione di trabecola e sonda). (E) Una trabecola (freccia rossa) è montata sul sistema sperimentale tra un trasduttore di forza (a sinistra) e un motore (centro-destra), ed è fiancheggiata da due cavi di stimolazione (orizzontale sopra e sotto la trabecola). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Tracce rappresentative e risultati . (A) Una singola trabecola cardiaca illuminata utilizzando una luce LED a collo d’oca con un angolo ripido (~ 75°) rispetto all’asse della lente del microscopio, che migliora il contrasto della trabecola. In questo esempio, due immagini sono affiancate per mostrare l’intera lunghezza della trabecula. (B) Curve stress-time (superiore) e strain-time (inferiore) per la stessa trabecula. Viene mostrata una contrazione isometrica, insieme a tre contrazioni di morsetto di carico a velocità di deformazione sistolica di fine crescente. (C) Calcolo MCR rappresentativo. MCR è definito come la pendenza della linea tra il tasso di rilassamento e il tasso di deformazione. Come osservato nella discussione, le velocità di deformazione possono essere limitate per fornire un MCR quantitativo e riproducibile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Tabella 1: Soluzioni. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Il controllo meccanico del rilassamento (MCR) quantifica la dipendenza del tasso di rilassamento miocardico dalla velocità di deformazione delrilassamento muscolare 8,9. La velocità di deformazione, piuttosto che il postcarico, è necessaria e sufficiente per modificare la velocità di rilassamento8. Poiché gli interventi per modificare il tasso di calcio non hanno dimostrato di migliorare sostanzialmente il rilassamento cardiaco, l’intervento meccanico può fornire nuove informazioni sul meccanismo e fornire un nuovo trattamento per la disfunzione diastolica.

Il protocollo per modificare la velocità di deformazione miocardica qui descritta utilizza un load-clamp isotonico 8,9. Un punto di forza del morsetto di carico isotonico è il controllo quantitativo dello stress di postcarico. I protocolli simili a Windkessel potrebbero essere utilizzati per sondare ulteriormente i cambiamenti nel postcarico, nel precarico e nel lavoro cardiaco 2,6,7. Una rampa non controllata dal bloccaggio di carico potrebbe anche essere utilizzata per isolare meglio la variazione della deformazione dalla velocità di deformazione. Indipendentemente da ciò, il postcarico stesso non sembra essere un forte modificatore del tasso di rilassamento8.

Il protocollo può anche essere adattato per avvicinarsi a condizioni più fisiologiche per la temperatura e la velocità di stimolazione. I dettagli del protocollo corrente sono stati utilizzati per mostrare la presenza del MCR. La conduzione di esperimenti in condizioni fisiologiche è generalmente raccomandata, a seconda della domanda sperimentale. Tuttavia, gli esperimenti eseguiti a 37 ° C, o ad alte velocità di stimolazione, possono indurre più rapidamente il rundown (danno) al muscolo. Potrebbe essere necessaria una soluzione con una migliore capacità di trasporto dell’ossigeno. Inoltre, l’acquisizione dei dati deve essere in grado di campionare la lunghezza e la forza abbastanza velocemente da risolvere le contrazioni rapide e fornire il controllo del feedback.

Il protocollo attuale non descrive la misurazione del calcio o la misurazione e il controllo delle lunghezze del sarcomero. Le misurazioni del calcio sono state affrontate in altri protocolli11, mentre la misurazione della lunghezza del sarcomero può essere aggiunta con attrezzature appropriate. Il controllo della lunghezza del sarcomero non è utilizzato negli attuali studi MCR, perché la lunghezza muscolare è il parametro più correlativo alla condizione clinica19. Un ulteriore controllo della lunghezza del sarcomero (rispetto al controllo della lunghezza muscolare) fornirebbe risposte specifiche alle domande cinetiche, ma è improbabile che aggiunga conoscenze traslazionali a causa della variazione inter-sarcomero e della comprensione minima dei cambiamenti di lunghezza del sarcomero in vivo.

Tre considerazioni sperimentali sono evidenziate qui per aumentare la riproducibilità dei dati.

In primo luogo, le trabecole cardiache indipendenti possono essere difficili da trovare in alcuni animali (risultati e comunicazioni non pubblicati). Mentre i muscoli contrazioni possono essere trovati nella maggior parte dei ratti, un tasso di successo ragionevole per ottenere dati dalla trabecola nei ratti è uno su tre. Il successo di Trabecula potrebbe essere maggiore con i ratti Brown Norway x Lewis F1, che sono stati anche usati storicamente20 e segnalati per avere più trabecole (comunicazioni non pubblicate). Per i topi, è probabile che i tassi di successo siano inferiori, con meno di uno su 10 previsto per i topi provenienti da un background BL / 6; tuttavia, si prevede un tasso più elevato per i topi provenienti da un background FVBN (comunicazioni e osservazioni non pubblicate).

In secondo luogo, i danni ai muscoli possono ridurre la produzione. Se le forze sviluppate sono inferiori a 10 mN mm-2 a 25 °C e 0,5 Hz di frequenza, i ricercatori potrebbero dover eseguire la risoluzione dei problemi per valutare se si sta verificando uno stiramento involontario o un contatto tra pinze metalliche e muscoli, se le soluzioni non sono adeguatamente preparate o se la stimolazione o le apparecchiature sperimentali funzionano correttamente. Altri protocolli che utilizzano trabecola intatta hanno suggerito l’uso di siringhe Luer-lock come vasi di trasferimento11. Mentre questo è possibile, soprattutto se l’utente controlla una portata molto lenta o un segmento muscolare più piccolo, il protocollo attuale utilizza una pipetta di trasferimento del foro molto più grande per ridurre al minimo i possibili danni. Un altro passo in cui può verificarsi un danno ischemico è durante la dissezione. L’aorta deve essere cannulata e lavata con soluzione di perfusione entro 3 minuti dal primo taglio addominale (ratto) o dalla lussazione cervicale (topo), analogamente ai limiti elencati nei protocolli di isolamento dei cardiomiociti21,22. Ciò riduce al minimo il tempo in cui il tessuto cardiaco non è esposto alla soluzione di perfusione simile alla cardioplegia. Inoltre, le dissezioni che durano più di 30 minuti generalmente non producono trabecole contrazioni. Pertanto, gli operatori dovrebbero praticare una dissezione rapida ma attenta per ridurre al minimo i danni. Un’area della sezione trasversale superiore a 0,2 mm 2 (2 x 10-7 m2) può soffrire di ischemia core20.

In terzo luogo, dovrebbe essere considerato il modo in cui i muscoli sono attaccati al motore e al trasduttore di forza. Questo protocollo attualmente si concentra su ganci e trabecole indipendenti. La velocità di sforzo a volte rapida dello stiramento prima del rilassamento può far scivolare un muscolo se non fissato correttamente, motivo per cui l’attuale protocollo non utilizza “ceste” per tenere la trabecola23,24. Possono essere considerati e convalidati anche metodi di montaggio alternativi (adesivi, clip, ecc.25,26). Il protocollo qui descritto utilizza trabecole e non muscoli papillari. Le corde del muscolo papillare inducono una serie di elasticità che può inibire i cambiamenti al MCR9. Tuttavia, è improbabile che l’esatta posizione degli attacchi nel muscolo influisca sulle misure, perché la lunghezza (e il diametro) della trabecola variano in modo sostanziale.

Una limitazione del piercing delle estremità muscolari con ganci è che anche il punto di montaggio stesso può essere danneggiato. Possibile strappo del tessuto muscolare apposto con frequenti contrazioni (a seconda della loro forza) può modificare la lunghezza o l’elasticità della serie. Questo tasso di lacrimazione è difficile da controllare. Allo stesso modo, i danni al tessuto e al gancio possono essere esacerbati durante lo stretching, causando anche potenzialmente problemi. L’ispezione visiva e i valori di forza sviluppati che rimangono >80% della forza isometrica equilibrata devono essere utilizzati per valutare se il preparato è danneggiato e devono essere esclusi.

Un’altra limitazione o considerazione riguarda quali domande sperimentali possono essere risolte dal metodo. Ad esempio, si consideri l’uso di 2,3-butanedione monoxime (BDM) nella soluzione di perfusione. BDM è una fosfatasi, che può alterare la funzione del muscolo. Inoltre, il lungo periodo di scarico e la mancanza di ritmo significano che lo stato di fosforilazione latente è probabilmente cambiato. Pertanto, si dovrebbe usare cautela quando si cerca di valutare direttamente la contrattilità muscolare di un animale (rispetto alle differenze tra genotipi o trattamenti), poiché lo stato contrattile è probabilmente cambiato. Tuttavia, l’impatto della fosforilazione può essere valutato farmacologicamente aggiungendo un agonista o un antagonista della via.

In sintesi, MCR fornisce informazioni su come il rilassamento è regolato dal movimento muscolare (tasso di sforzo). MCR può aiutare a fornire una migliore comprensione della diagnosi e del monitoraggio della malattia diastolica, insieme a obiettivi per l’intervento farmacologico, come la modifica della cinetica della miosina. Il protocollo e i consigli qui delineati espongono le conoscenze sviluppate nel corso di diversi anni di studi e dovrebbero essere applicabili ad altri sistemi e modelli di malattie cardiache.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato dal National Institutes of Health (1R01HL151738) e dall’American Heart Association (18TPA34170169).

Materials

18 or 16 gauge blunted needle/canula for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop
2,3-Butanedione Monoxime Sigma-Aldrich B0753-25G
23 gauge blunted needle/canula for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop
5 mL syringe BD Luer-Lock 309646
95% Oxygen/5% CO2 AirGas Z02OX9522000043
Anethesia system EZ Systems EZ-SA800 Can use any appropriate anethesia method/system
Bovine Serum Albumin Fisher BioReagents BP-1600 to coat tips of fine forcepts, scissors
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Chemical C79-500
Containers/dissection dishes FisherBrand 08-732-113 Weigh dishes for creating dissection plates
Crile Hemostat Fine Science Tools 13005-14 for mouse gross dissection
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
Data acquisition software SLControl
Data acquisition system MicrostarLabs DAP5216a Can use any DAQ.  This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot
Data analysis software Mathworks Matlab Custom Script
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11231-30 2x for cannulation of aorta
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11254-20 2x for trabecula isolation
Experimental system Aurora Scientific 801C Can use any appropriate experimental chamber with force and length control
Fine Scissors, curved Fine Science Tools 14061-09 for removal of heart
Gooseneck Piggyback Illuminator AmScope LED-6WA
HEPES Sigma-Aldrich H3375-250G
Imaging software IrfanView
Iris Forceps World Precision Instruments 15915 for removal of heart
Isoflurane VetOne 502017
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma-Aldrich M2670-100G
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506-500G
Mayo Scissors Fine Science Tools 14110-15 for rat gross dissection
Metzenbaum Scissors Fine Science Tools 14116-14 for mouse gross dissection
Microscope connected camera Flir BFS-U3-27S5M-C Includes acquisition software
Microscope/digital imaging system Olympus IX-73 Can use any appropriate microscope.  Needed to measure muscle length, cross sectional area
Mounting Pin/Needle BD PrecisionGlide 305136 For holding heart to dish.  27 G x 1-1/4
Mounting Pin/Needle Fine Science Tools 26000-40 For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle)
Oxygen (O2) AirGas OX USP300
Peristaltic Pump Rainin Rabbit Can be any means to create flow in experimental chamber
pH and Oxygen sensor Mettler Toledo SevenGo pH and DO
Potassium Bicarbonate Sigma-Aldrich 237205-100G
Potassium Chloride Fisher Chemical P217-500
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich 795488-500G
Rochester-pean Hemostat World Precision Instruments 501708 for rat gross dissection
Silk Suture, Size: 4/0 Fine Science Tools 18020-40 cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888-1KG
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S7907-100G
Stereomicroscope AmScope SM-1TX
Student Vannas Spring Scissors  Fine Science Tools 91500-09 for opening of the RV
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base Dow Corning 3097358-1004 For creating dissection plates
Syringe Holder Harbor Frieght Helping Hands 60501 Can be used as alternate for ring stand
Taurine Sigma-Aldrich T0625-1KG
Transfer Pipette FisherBrand 13-711-7M cut ~1" from tip to widen bore
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00 for trabecula isolation
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References

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Bukowski, M. J., Cavanaugh, B., Abbo, A., Chung, C. S. Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae. J. Vis. Exp. (192), e64879, doi:10.3791/64879 (2023).
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