Метод 3D-культивирования сфероидов клеточных линий эмбриональных и печеночных рыбок данио-рерио
Summary
Здесь мы представляем эффективный, простой и быстрый протокол 3D-культивирования для формирования сфероидов двух клеточных линий рыбок данио-рерио (Danio rerio): ZEM2S (эмбрион) и ZFL (нормальный гепатоцит).
Abstract
Клеточные линии рыб являются перспективными моделями in vitro для оценки экотоксичности; однако обычные монослойные культивальные системы (2D-культура) имеют хорошо известные ограничения (например, долговечность культуры и поддержание некоторых клеточных функций in vivo ). Таким образом, были предложены 3D-культуры, такие как сфероиды, поскольку эти модели могут воспроизводить тканеподобные структуры, лучше захватывая условия in vivo . В этой статье описывается эффективный, простой и быстрый протокол 3D-культивирования для формирования сфероидов с двумя клеточными линиями рыбок данио-рерио (Danio rerio): ZEM2S (эмбрион) и ZFL (нормальный гепатоцит). Протокол состоит из покрытия ячеек в 96-луночную пластину со сверхнизким дном и сверхнизкой насадкой. После 5 суток при орбитальном встряхивании (70 об/мин) образуется один сфероид на лунку. Сформированные сфероиды имеют стабильный размер и форму, и этот метод позволяет избежать образования нескольких сфероидов в яме; Таким образом, нет необходимости вручную подбирать сфероиды одинаковых размеров. Легкость, скорость и воспроизводимость этого сфероидного метода делают его полезным для высокопроизводительных испытаний in vitro .
Introduction
Сфероиды представляют собой небольшие сферы клеток, образующиеся при культивировании клеток в тесном межклеточном контакте в 3D-культуре. Способность сфероидов имитировать тканевую среду in vivo уже была изучена в различных клеточных линиях и первичных клетках 1,2. Однако, несмотря на то, что сфероиды хорошо разработаны для исследований токсичности для млекопитающих, разработка сфероидов для исследований токсичности для позвоночных, не относящихся к млекопитающим (например, рыб), все еще продолжается3. Для клеточных линий рыб сфероиды были разработаны различными методами, такими как орбитальное встряхивание (OS) с использованием различных типов лунок 3,4,5,6,7 и метод магнитной левитации с использованием магнитных наночастиц 8. Однако некоторые из этих методов культивирования сфероидов могут иметь больше недостатков, чем другие.
Например, гирационные методы в больших микропланшетах (24-луночные пластины) могут генерировать большое количество сфероидов, различающихся по размеру и форме; Действительно, было продемонстрировано формирование многосфероидной структуры7. Это требует интенсивных усилий по подбору сфероидов аналогичного размера и формы для эксперимента. Метод 3D-культивирования висячей капли обычно используется для получения сфероидов клеточных линий млекопитающих 1,2,9,10,11, при этом можно генерировать отдельные сфероиды на каплю, избегая проблем, описанных выше. Однако, хотя модифицированный метод висячего падения (висячая капля + орбитальное встряхивание) способен генерировать сфероиды ZFL с помощью недорогого метода, он имеет свои недостатки12. Образовавшиеся клеточные агрегаты не могут долго сохраняться в каплях; Таким образом, их нужно переносить на скважинные пластины. Этот процесс требует интенсивного обращения и длительных периодов работы в вытяжке с ламинарным потоком, поскольку он выполняется по каплям с помощью микропипетки12. Кроме того, для полного формирования сфероидов ZFL этому методу требуется 10 дней (5 дней в висячей капле + 5 дней в ОС)12. Эти недостатки могут ограничить применение 3D-сфероидов рыб для тестирования токсичности, особенно с учетом потенциальных применений для определения приоритетов химических веществ и устойчивости продукта.
Таким образом, в данной статье описан протокол 3D-культивирования, способный генерировать одиночные сфероиды клеточных линий ZFL (D. rerio normal hepatocyte) и ZEM2S (эмбрион D. rerio blastula phase) на основе комбинированного использования 96-луночных пластин со сверхнизким креплением (ULA-пластины) и орбитального шейкера (диаметр вращения 22 мм). Применяемый метод прост и воспроизводим и может генерировать большое количество сфероидов одинакового размера и формы за короткий период (5 дней). Преимущества этого метода могут способствовать применению 3D-моделей рыб для исследований токсичности в водной среде как в промышленности, так и в научных кругах, а также прогрессу внедрения альтернативных методов тестирования экотоксичности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это простой, легкий и быстрый метод создания сфероидов клеточных линий печени и эмбрионов рыбок данио. Этот метод был разработан этой группой на основе модификаций существующих методов 3D-сфероидов для преодоления проблем, о которых сообщалось в научных исследованиях, связанных с обра?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Памяти доктора Марсио Лоренчини, соавтора этой работы, выдающегося исследователя в области косметики и посвященного продвижению косметических исследований в Бразилии. Авторы выражают благодарность Многопользовательской лаборатории кафедры физиологии (UFPR) за наличие оборудования и финансовую поддержку Координационного центра по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES, Бразилия) (Финансовый код 001) и Grupo Boticário.
Materials
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS – Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids – A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022)
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
