Редактирование генов первичных В-клеток макак-резусов

Все процедуры и эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальных институтов здравоохранения. Краткое изложение следующих протоколов представлено на рисунке 1. Самцы и самки макак-резусов (Macaca mulatta) индийского генетического происхождения в возрасте от 2 до 8 лет содержались и ухаживали за ними в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за лабораторными животными и их использованию на объекте 2-го уровня биобезопасности. ВНИМАНИЕ: Все эксперименты проводились с соблюдением универсальных мер предосторожности в отношении патогенов, передающихся через кровь, с использованием стерильных/асептических методов и надлежащего оборудования уровня биобезопасности 2 в вытяжных шкафах с ламинарным потоком. 1. Производство rAAV6 Подготовьте реагенты для производства rAAV6.Спроектируйте и клонируйте шаблон репарации, направленный на гомологию, между инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV2 в векторе pAAV с использованием стандартных методов. Убедитесь, что плечи гомологии имеют не менее ~ 250.н. с каждой стороны, но может быть достаточно всего 60.н., хотя более длинные плечи гомологии предпочтительнее, если конструкция конструкции позволяет это. Если в HDRT присутствуют целевые последовательности какой-либо из используемых сгРНК, удалите их с помощью тихих мутаций, которые наиболее эффективны в соседнем мотиве протоспейсера или затравочной области целевого сайта.ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез генов в сочетании со сборкой Гибсона для эффективного клонирования32 может быть выполнен. Подготовьте Maxiprep правильного клона для трансфекции. Для дизайна sgRNA рекомендуется CHOPCHOP33, а список других инструментов можно найти на https://zlab.bio/guide-design-resources. Максимальная емкость упаковки для AAV, включая РМЭ, составляет ~ 4,7 КБ. AAV6 является наиболее часто используемым серотипом для редактирования гемопоэтических клеток, особенно В-клеток9. Другие серотипы AAV для редактирования генов В-клеток макак-резусов не тестировались, но AAV28 и AAV-DJ10,11 использовались в исследованиях на мышах. Подготовьте питательную среду 293AAV и продукционную среду в соответствии с таблицей 1 и таблицей 2. Стерильный фильтр через мембранный фильтрующий блок из полиэфирсульфона (PES) 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C. Приготовьте 1x раствор полиэтиленимина (PEI) (1 мг / мл, 100 мл). В стеклянном стакане объемом 250 мл нагрейте ~ 70 мл H2O в микроволновой печи в течение ~ 30 с, а затем добавьте 100 мг PEI. Добавьте магнитную мешалку и перемешивайте, пока PEI не растворится. Отрегулируйте pH до 7 с помощью 1 M HCl, затем долейте до 100 мл H2O, подождите 10 минут, снова проверьте pH и при необходимости отрегулируйте. Стерильно отфильтруйте раствор PEI через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм, аликвоту и храните при температуре -20 °C. После размораживания раствор можно хранить при температуре 4 °C до 2 месяцев. Приготовьте 5-кратный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ)/NaCl. Взвесьте 400 г ПЭГ, 8 000 и 24 г NaCl. Добавьте магнитную мешалку в стеклянный стакан объемом 2 л, добавьте взвешенный PEG 8,000 и NaCl и промойте ~ 550 мл деионизированной воды. Перемешайте при нагревании и доведите до кипения или 80-90 °C до полного растворения. Отрегулируйте pH до ~ 7,4 с помощью 1 М NaOH, затем отрегулируйте объем до 1 л с помощью мерного цилиндра и перелейте его в стеклянную бутылку объемом 2 л с помощью магнитной мешалки. Автоклавную бутылку, магнитную мешалку и раствор на водяной бане в течение 30 мин при 121 °С. После автоклавирования охладите раствор в холодном помещении, помешивая, используя магнитную мешалку, чтобы предотвратить разделение на разные фазы. При необходимости аликвотировать и хранить при температуре 4 °C. Подготовьте буфер для рецептуры. Смешайте 500 мл DPBS с 50 мкл 10% Pluronic F-68. Стерильный фильтр через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм и хранение при комнатной температуре (RT). Клеточная культура, трансфекция и трансдукция для производства rAAV6Размораживают, культивируют и замораживают клетки 293AAV, как описано производителем, используя вышеуказанную питательную среду 293AAV и трипсин-ЭДТА для расщепления. Рекомендуется заморозить некоторые ранние проходы и использовать клетки для производства AAV до того, как они достигнут прохода 40. Для производства rAAV6 посейте четыре чашки для клеточных культур диаметром 15 см по 5 x 106 клеток по 30 мл каждая. Клетки готовы к трансфекции обычно через 1-2 дня после посева, когда они достигают 80%-90% слияния. Разморозьте Maxiprep плазмиды pAAV, содержащей HDRT, для упаковки в AAV6. Ресуспендируют 85,6 мкг плазмиды pAAV в 3 мл чистой среды DMEM. Растворите 342 мкл 1 мг/мл раствора PEI в 3 мл чистой среды DMEM. Инкубируйте оба раствора в течение 10 мин при ЛТ. Смешайте обе пробирки по 3 мл в одну пробирку с ~ 6,4 мл смеси для трансфекции и инкубируйте в течение 20 мин при ЛТ. Тем временем разморозьте самомолчающий вспомогательный вектор RepCap6 с поддержкой тетрациклина из морозильной камеры с температурой -80 °C на водяной бане с температурой 37 °C. Чтобы трансдуцировать клетки 293AAV, добавьте вспомогательный вектор при кратности инфекции (MOI) 25, используя среднюю инфекционную дозу культуры тканей (TCID50) и предполагая, что 1,15 x 107 клеток / чашка; обычно используется 2-10 мкл на 15-сантиметровую тарелку. Аккуратно покачайте и взболтайте посуду, чтобы распределить. После инкубации смеси для трансфекции добавьте по каплям 1,6 мл в каждую из четырех 15-сантиметровых посуд. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, если интересующие векторы rAAV6 уже доступны, эти векторы могут быть использованы для обеспечения вирусного генома, подлежащего упаковке, что сводит на нет необходимость в каких-либо плазмидах с этой системой и дает сопоставимые титры rAAV6. Для этого подхода клетки 293AAV трансдуцируются совместно с желаемым rAAV6 при MOI 50 (на основе копий генома rAAV6 [GC] / мл) вместе со вспомогательным вектором. На следующий день тщательно аспирируйте и выбросьте питательную среду и замените 30 мл предварительно подогретой производственной среды. Инкубируйте еще 96 ч до сбора урожая. Для получения максимальной урожайности не рекомендуется дальнейшая смена среды. Сбор и очистка рекомбинантного AAV6 из средыНе вытесняя клетки из чашки, соберите всю надосадочную жидкость клеток в фильтрующий блок с мембраной PES размером 0,2 мкм, по крайней мере, на 50% больше, чем объем фильтруемой среды. Затем отфильтруйте надосадочную жидкость.ПРИМЕЧАНИЕ: Если желателен более высокий выход rAAV6, клетки могут быть собраны и rAAV извлечен из клеточного гранулирования с использованием коммерческих наборов или установленных протоколов34,35. Поскольку AAV6 в основном секретируется в среду36, использовался только надосадочная жидкость, что сокращало трудозатраты, затраты и время. Добавьте 5 растворов ПЭГ/NaCl в отфильтрованную надосадочную жидкость на 25% от собранного объема; обычно это 30 мл, если используются четыре 15-сантиметровые чашки по 30 мл. Хорошо перемешайте, перевернув, а затем инкубируйте в течение ночи при температуре 4 ° C, чтобы вирусные частицы выпали в осадок.ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы AAV стабильны до 2 дней в этом растворе. Предварительно охладите центрифугу с поворотным ведром с 250 мл пробирочных вкладышей до 4 °C. Подготовьте центробежный фильтрующий блок объемом 4 мл с отсечкой 100 кДа и гидрофильный шприцевой фильтр PES 0,22 мкм путем предварительной обработки каждой мембраны 2 мл 10% плюроника F-68 в течение не менее 1 ч при ЛТ. Переложите смесь AAV-PEG/NaCl в пробирку объемом 250 мл, центрифугу при 2 500 x g в течение 1 ч при 4 °C, а затем осторожно удалите всю надосадочную жидкость путем аспирации. Ресуспендируйте вирусную гранулу от бежевого до белого путем вихривания в 4 мл 1 M HEPES до полной ресуспендирования. При необходимости дайте ему постоять 5 минут и снова встряхните. Ресуспендируют с помощью серологической пипетки объемом 5 мл и переносят общий объем в пробирку объемом 15 мл. В вытяжном шкафу добавьте равный объем хлороформа к вирусной суспензии – обычно 4 мл. Энергично вихревите в течение 2 мин, а затем центрифугу при 1000 x g в течение 5 мин при RT. Соберите верхний слой (надосадочную жидкость, содержащую AAV) в новую пробирку объемом 50 мл и выбросьте нижний слой (хлороформ).ВНИМАНИЕ: Растворы, содержащие хлороформ, являются опасными отходами. Следуйте институциональным рекомендациям по его утилизации. Поместите надосадочную жидкость, содержащую AAV, под вытяжной шкаф и дайте оставшимся хлороформу испариться в течение 30 минут. Тем временем промойте предварительно обработанный центробежный фильтрующий блок и шприцевой фильтр. Добавьте 1,5 мл буфера для рецептуры в предварительно обработанный центробежный фильтрующий блок. Центрифуга при 3 500 x g в течение 10 мин при 15 °C в роторе качающегося ковша. Повторите этот шаг с 4 мл буфера состава, чтобы промыть мембрану. Дважды промойте фильтр шприца 5 мл буфера для рецептуры с помощью шприца объемом 5 мл. Загрузите ~ 4 мл надосадочной жидкости, содержащей AAV, полученной при экстракции хлороформа, в шприц объемом 5 мл, прикрепите промытый шприцевой фильтр и отфильтруйте непосредственно в центробежный фильтрующий блок. Центрифугу при 3,500 x g в течение 25 мин при 15 °C, а затем убедитесь, что раствор AAV в фильтре составляет около 50-100 мкл. Если объем раствора составляет >100 мкл, продолжайте центрифугу. После удаления фильтрата добавьте 4 мл буфера для рецептуры в чашку центробежного фильтрующего блока и равномерно перемешайте раствор пипеткой. Центрифугу при 3,500 x g в течение 25 мин при 15 °C, а затем убедитесь, что раствор AAV в фильтре составляет 50-100 мкл. Если объем раствора составляет >100 мкл, продолжайте центрифугу. Повторите этот шаг для еще одной стирки. После окончательного центрифугирования убедитесь, что объем раствора составляет 50-70 мкл; Если нет, продолжайте центрифугу. Переведите препарат в пробирку объемом 1,5 мл. При желании аликвотировать и хранить при температуре −80 °C. Определение титра рекомбинантного AAV6 методом кПЦРПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры для кПЦР отжигаются в области ИТР и, таким образом, должны быть пригодны для всех конструкций, клонированных в pAAV.Разморозьте аликвоту rAAV6, подлежащего титру, и аликвоту эталонного материала AAV6. Эталонный материал AAV6 должен быть близок к 4 x 1011 ГЦ/мл; В противном случае отрегулируйте разбавление соответствующим образом. Проведите дижест ДНКазы I, чтобы удалить оставшуюся свободную плазмидную ДНК в препарате rAAV6, объединив 2,0 мкл образца или эталонного материала AAV6 с 15,6 мкл безнуклеазного H 2 O,2,0мкл 10-кратного буфера ДНКазы I и 0,4 мкл ДНКазы I. Аккуратно перемешайте и выдержите в течение 30 минут при 37 °C, а затем переложите на лед. Это разбавление 1 (см. таблицу 3). Приготовьте пятикратное серийное разбавление всех образцов и эталонного материала AAV6, как показано в таблице 3 ниже, водой. Приготовьте мастер-микс для кПЦР SYBR Green. На лунку смешайте 4,7 мкл безнуклеазной воды с 10 мкл основной смеси SYBR Green, 0,15 мкл праймера ITR вперед при 100 мкМ и 0,15 мкл праймера ITR в обратном направлении при 100 мкМ.ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая проба измеряется в двух экземплярах, с 16 скважинами для эталонного стандарта, 8 скважинами на образец и 2 скважинами для контроля без шаблона. Приготовьте на 10% больше мастер-микса, чтобы учесть ошибку пипетирования. В оптическую 96-луночную или 384-луночную реакционную пластину загрузите 15 мкл на лунку мастер-смеси SYBR Green qPCR. Затем загрузите 5 мкл образцов и эталонный материал AAV6 или воду без нуклеазы для контроля без шаблона. Для эталонного стандарта AAV6 разбавление нагрузки 2 до разбавления 9. Для образцов загружают разбавление 5 до разбавления 8. Измеряйте каждое разведение в двух экземплярах. Избегайте пузырьков. Запечатайте загруженную пластину оптической прозрачной пленкой, центрифугу при 800 x g в течение 1 минуты при RT и загрузите пластину в прибор qPCR с соответствующей установкой на 96 или 384 лунки. Настройте и запустите прибор qPCR с помощью детектирования SYBR со следующими условиями циклирования: 98 °C в течение 3 мин, затем 40 циклов 98 °C в течение 15 с и 58 °C в течение 30 с, после чего следует кривая плавления. Проанализируйте данные с помощью программного обеспечения прибора, используя концентрацию эталонного материала AAV6 в копиях генома на миллиметр (ГХ/мл) в качестве стандартной кривой (см. Таблицу 3). Рассчитайте конечную концентрацию образца путем умножения на коэффициент разбавления. Убедитесь, что стандартная кривая R2 близка к 1,0, эффективность ПЦР составляет 90% -110%, базовый уровень удален, кривая плавления показывает один пик, значения C t изменяются в соответствии с разведениями, а дубликаты находятся в пределах 0,5 Ct; В противном случае исключите выбросы. Ожидаем урожайность, как показано на рисунке 2. 2. Подготовка В-клеточных сред и стимулов Подготовьте размораживающую среду: смешайте RPMI-1640 с 20% FCS. Стерильный фильтр через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C. Подготовьте среду для культивирования В-клеток: смешайте реагенты, указанные в таблице 4, а затем проведите стерильную фильтрацию через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C. Ресуспендировать каждый из стимуляторов В-клеток, указанных в таблице 5 , в исходных концентрациях в среде для культивирования В-клеток, за исключением CpG ODN, который следует ресуспендировать в воде, не содержащей нуклеаз. Хранить при температуре −80 °C. При отрицательном истощении неВ-клеток (необязательный шаг 4) приготовьте DPBS (без кальция, без магния) с 2% FCS (DPBS 2% FCS). Стерильный фильтр через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C. 3. Получение и культивирование В-клеток макак-резусов ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервированные макак-резусы PBMC или спленоциты используются для создания клеточной культуры30,31. Предварительно подогрейте размораживающую среду и питательные среды В-клеток на водяной бане с температурой 37 °C. Разморозьте стимуляторы В-клеток из таблицы 5 на льду. Подготовьте трубку подходящего размера, содержащую предварительно разогретую талую среду. В идеале это должно быть более чем в 10 раз больше объема размороженных клеток. Разморозьте один-два криовиала PBMC или спленоцитов за раз на водяной бане с температурой 37 ° C и сцедите в подготовленную пробирку с предварительно подогретой средой. Промойте криотрубки, чтобы собрать все клетки. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 10 мин при RT.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки центрифугирования снижают загрязнение тромбоцитов, сохраняя при этом выход PBMC. Можно использовать более высокие скорости, такие как 350 x g в течение 5 минут. Ресуспендируйте клетки в 10 мл размораживающей среды для промывки. Повторите шаги 3.4 и 3.5, в общей сложности три центрифугирования для удаления замораживающей среды. После последнего центрифугирования ресуспендируют клетки в расчетной дозе ~ 5 x 106 клеток/мл в среде для культивирования В-клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном выше протоколе культивируют целые препараты PBMC или спленоцитов с контаминацией другими клетками. Если требуются более чистые культуры В-клеток, хотя и при значительно сниженном общем выходе В-клеток, переходите к шагу 4. Никаких различий в эффективности редактирования между этими двумя методами не наблюдалось. При необходимости разбавьте аликвоту 10 мкл клеток питательной средой В-клеток для подсчета. Подсчитывают с помощью гемоцитометра и окрашивают трипановым синим, сочетая равные объемы ресуспендированных клеток и 0,4% раствора трипанового синего. Отрегулируйте концентрацию клеток до 3 x 106 клеток / мл со средой для культивирования В-клеток в соответствии с количеством клеток. Затем добавьте стимуляторы В-клеток к их конечным концентрациям в соответствии с таблицей 5 и перемешайте. Перенесите клетки в соответствующую чашку для клеточных культур. В целом, рекомендуется 0,6 х 10 6-0,7 х 106 клеток/см2. Инкубируют клетки при 37 °C с 5%CO2 в течение 48 ч ± 2 ч. 4. Необязательное отрицательное истощение не-В-клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Выход и чистота зависят от процентного содержания В-клеток на входе среди PBMC, который может сильно различаться у отдельных макак-резусов27. Ожидайте чистоту 80%-95%, эффективность 60% и 1 x 10 6-1,5 x 106 ячеек от 1 x 107 PBMC. После последней промывки (этап 3.6) ресуспендируйте клетки в концентрации 1 x 108 клеток/мл в DPBS 2% FCS и человеческом Fc-блоке, разбавленном в соотношении 1:200. Количество ячеек основано на количестве размороженных ячеек. Инкубировать в течение 15 мин на льду, чтобы блокировать Fc-рецепторы, а затем добавить биотинилированные антитела, указанные в таблице 6. Инкубировать еще 20 мин на льду. Долейте в тюбик DPBS 2% FCS и отжимайте при 200 x g в течение 10 мин при 4 °C. Ресуспендируют клетки в DPBS 2% FCS на 80% объема из шага 4.1 (т.е. 80 мкл на 1 x 107 клеток). Добавьте магнитные шарики стрептавидина в суспензию клетки в количестве 20% от объема из шага 4.1 (т.е. 20 мкл шариков на 1 x 107 ячеек). Инкубируйте клетки в течение 15 минут на льду и периодически перемешивайте. Между тем, на 1 х 108 ячеек подготовьте магнитный сепаратор с большой магнитной обеднительной колонной и фильтром предварительного разделения. Промойте фильтр и колонку предварительного разделения 2 мл DPBS 2% FCS под действием силы тяжести и откажитесь от проточного потока. Установите пробирку для сбора 15 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование других колонн, таких как колонны с положительным отбором или другие системы очистки магнитных шариков, может резко снизить чистоту. После инкубации дополните клетки до 0,5 мл DPBS 2% FCS, если объем составляет <0,5 мл. Если объем составляет ≥0,5 мл, просто продолжайте. Загрузите клеточную суспензию в фильтр предварительного разделения на подготовленной колонке и соберите проточный поток в пробирку объемом 15 мл. Дважды упраздните несвязанные обогащенные В-клетки, добавив 1 мл DPBS 2% FCS в фильтр предварительного разделения. Соберите несвязанные клетки в одну и ту же трубку под действием силы тяжести.ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительное элюирование может незначительно увеличить урожайность. Чистота и эффективность могут быть оценены с помощью проточной цитометрии входных клеток, обогащенных клеток и клеток, удерживаемых на колонке. Чтобы получить ячейки, удерживаемые на колонке, снимите колонку с магнита и промойте 3 мл DPBS 2% FCS с помощью прилагаемого поршня. При желании оцените чистоту с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 3 , используя реагенты в таблице 7. Центрифугируйте обогащенные В-клетки в дозе 200 x g в течение 10 мин при 4 °C. Ресуспендируют клетки при расчетной дозе ~ 5 x 106 клеток / мл в среде для культивирования В-клеток и продолжайте на шаге 3.7. 5. Первичное редактирование генов В-клеток макак-резусов После активации В-клеток макак-резусов в течение 48 ч ± 2 ч готовят реагенты для электропорации и трансдукции.Предварительно разогрейте ДМСО, безнуклеазный дуплексный буфер, буфер T и буфер E (набор для электропорации 10 мкл) или E2 (набор для электропорации 100 мкл) из набора для электропорации в RT. Разморозьте rAAV6 HDRT и В-клеточные стимуляторы из таблицы 5 на льду. Ресуспендировать сгРНК CRISPR-Cas9 при 100 мкМ в дуплексном буфере. Восстановите в течение 10 минут при RT и смешайте вихревом и щелчком. Храните восстановленные сгРНК на льду до использования. Хранить при температуре −80 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: СгРНК CRISPR-Cas9 могут быть разработаны с помощью различных онлайн-инструментов (см. 1.1.1) и могут сильно различаться по эффективности резки. Эмпирическое тестирование эффективности резки рекомендуется проводить с использованием таких анализов, как TIDE37 или ICE38. На 10 мкл электропорации готовят 550 мкл среды для культивирования В-клеток со всеми стимуляторами из таблицы 5 и добавляют 1% ДМСО. Увеличьте объемы в 10 раз для электропорации 100 мкл. Опционально 10% этой среды может быть приготовлено без антибиотика-антимикотика, что несколько повышает жизнеспособность клеток после трансфекции. На 10 мкл электропорации готовят лунку из 48-луночной клеточной культуральной пластины с 50 мкл питательной среды В-клеток со стимуляторами и без антибиотика-антимикотика, если он используется. Для электропорации 100 мкл пипеткой 500 мкл вводят в лунки 6-луночной пластины. Добавьте rAAV6 HDRT в среду в скважинах, до 20% объема в скважине. Стремитесь к MOI в диапазоне от 1 x 10 5-1 x 10 6 в зависимости от количества клеток на трансфекцию (электропорация 10 мкл: 5 x 10 5 клеток; электропорация 100 мкл:5 x 106 клеток) и GC в препарате rAAV6. Высокие концентрации запасов rAAV6 от 5 x 1013 ГХ/мл до 5 x 1014 ГХ/мл рекомендуются для достижения высоких MOI при небольших объемах.ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкие MOI могут привести к снижению эффективности редактирования, а MOI 5 x 105 , как правило, близки к максимальной эффективности редактирования, которую мы видели. Влияние различных MOI на жизнеспособность В-клеток не наблюдалось. Рекомендуется включать контрольную группу без rAAV6 HDRT, без трансфекции RNP и без обоих. Предварительно разогрейте подготовленную посуду и оставшуюся среду, переложив их в инкубатор при 37 °C с 5% CO2. На 10 мкл электропорации приготовьте 1,15 мкл рибонуклеопротеина (РНП): смешайте 0,4 мкл 61 мкМ Cas9 с 0,75 мкл 100 мкМ сгРНК в дуплексном буфере. Подготовьте дополнительно (рекомендуется на 30% больше для однократной электропорации) из-за ошибки пипетирования и во избежание образования пузырьков при загрузке наконечников для электропорации. Уменьшите масштаб в 10 раз для наконечников объемом 100 мкл. Инкубируйте RNP в течение не менее 15 минут при RT перед смешиванием с клетками. После инкубации несколько RNP могут быть объединены, если необходимо одновременно нацеливаться на более чем один локус. Никаких существенных различий в эффективности не наблюдалось одновременно с тремя локусами. Тем временем подготовьте клетки к электропорации. Всегда держите клетки в режиме RT, чтобы избежать температурных скачков. Заготавливают клетки через 48 ч ± 2 ч культуры в соответствующий сосуд. Промойте посуду DPBS, чтобы собрать максимальное количество ячеек. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 10 мин при RT. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клетки в DPBS при ~ 2 x 106 клеток / мл. Соедините 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего с 10 мкл клеточной суспензии и посчитайте с помощью гемоцитометра.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, из-за потери во время сбора урожая и промывки, ожидайте около 60% клеток, которые были помещены в культуру через 48 часов ± 2 часа раньше. Тем временем центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 10 минут при RT. Выбросьте надосадочную жидкость, убедившись, что все оставшиеся DPBS сведены к минимуму. Ресуспендируют клетки в предварительно нагретом (RT) буфере T при 5,55 x 107 клеток / мл в зависимости от приведенного выше количества клеток. Настройте систему трансфекции, включив аппарат и установив его на 1,350 В, 15 мс и 1 импульс. Поместите дозаторную станцию внутрь вытяжного шкафа с ламинарным потоком. Для каждого набора из 10 электропораций готовят трансфекционную трубку с 3 мл буфера E (для трансфекций 10 мкл) или E2 (для трансфекций 100 мкл). Вставьте трубку в дозатор. На 10 мкл электропорации объедините 1,15 мкл РНП с 9 мкл клеток. Убедитесь, что у вас достаточный объем (+ 30%), чтобы избежать аспирации воздуха в наконечник электропорации. Инкубировать при РТ в течение 1-2 мин перед электропорацией. Аспирируйте 10 мкл или 100 мкл РНП и клеточной смеси в электропорационный наконечник соответствующего размера на электропорационной пипетке, вставьте загруженную пипетку в дозаторную станцию и начните электропорацию. Убедитесь, что на наконечниках нет пузырьков воздуха, чтобы предотвратить искрение. Следите за электропорацией, чтобы убедиться, что дуга не возникает. Немедленно выталкивайте электропорированные ячейки в подготовленную, предварительно нагретую, небольшой объем среды с rAAV6 или без него внутри 48-луночной (10 мкл трансфекций) или 6-луночной пластины (100 мкл трансфекций). Повторите шаги 5.15-5.17 с оставшимися образцами. Добавьте контрольные образцы без трансфекции в культуральные лунки. Инкубируют клетки при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 4 ч ±2 ч, а затем добавляют подготовленную, предварительно подогретую среду для культивирования В-клеток, содержащую стимуляторы, ДМСО и антибиотик / антимикотическое средство: 450 мкл для 10 мкл трансфекции или 4,5 мл для 100 мкл трансфекций. Продолжайте инкубацию при 37 °C с 5% CO2 в течение12-24 часов. Затем измените среду на среду для культивирования В-клеток, содержащую стимуляторы и антибиотик / антимикотик без ДМСО, если требуется расширенное культивирование. Анализ геномной ДНК можно сделать через 24 часа. Цифровая капельная ПЦР с использованием праймера вне плеча гомологии и праймера внутри вкладыша может быть использована для количественной оценки эффективности редактирования39. Выполните ПЦР для амплификации места вставки и секвенирование по Сэнгеру, чтобы проверить правильность редактирования. Для анализа уровня белка культивируют клетки в течение 40-48 ч после электропорации, чтобы обеспечить изменения экспрессии белка, и проводят анализ с помощью проточной цитометрии с использованием реагентов, указанных в таблице 7.