Esrar sativasından Glandüler Kapitat Saplı ve Sapsız Trikomların Susuz İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi
Summary
Esrar sativa’dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, sadece sıvı azot, kuru buz ve naylon elekler kullanılarak trikomların kuru, tamponsuz ekstraksiyonuna dayanır ve RNA ekstraksiyonu ve transkriptomik analiz için uygundur.
Abstract
Bu yazıda, Cannabis sativa’dan glandüler kapitat saplı ve sapsız trikomların uygun ve yüksek verimli izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Kannabinoid ve uçucu terpen metabolizması için biyosentetik yollar öncelikle Esrar trikomlarında lokalize edilir ve izole trikomlar transkriptom analizi için faydalıdır. Transkriptomik karakterizasyon için glandüler trikomların izole edilmesine yönelik mevcut protokoller sakıncalıdır ve tehlikeye atılmış trikom kafaları ve nispeten düşük miktarda izole trikom sağlar. Ayrıca, RNA yıkımını önlemek için pahalı cihazlara ve protein inhibitörleri içeren izolasyon ortamına güvenirler. Bu protokol, sırasıyla C. sativa olgun dişi salkımından ve fan yapraklarından büyük miktarda izole glandüler kapitat saplı ve sapsız trikom elde etmek için üç bireysel modifikasyonun birleştirilmesini önermektedir. İlk modifikasyon, trikomların mikro eleklerden geçişini kolaylaştırmak için geleneksel izolasyon ortamı yerine sıvı azotun ikame edilmesini içerir. İkinci modifikasyon, trikomları bitki kaynağından ayırmak için kuru buz kullanmayı içerir. Üçüncü modifikasyon, bitki materyalinin azalan gözenek boyutlarına sahip beş mikro elek içinden art arda geçirilmesini içerir. Mikroskobik görüntüleme, izolasyon tekniğinin her iki trikom tipi için etkinliğini göstermiştir. Ek olarak, izole trikomlardan ekstrakte edilen RNA’nın kalitesi, aşağı akış transkriptomik analizi için uygundu.
Introduction
Glandüler trikomlar, birçok ikincil metabolit1 içeren bitkilerde bulunan ve yeni biyosentetik genlerin ve enzimlerin değerli bir bankasını temsil eden saç benzeri yapılardır2. Esrarda, önemli ikincil metabolitlerin, kanabinoidler3 ve terpenler4’ün biyosentezi, trikomlarda lokalizedir. Trikomların hem tıbbi hem de rekreasyonel kullanımlar için Esrar kalitesini belirlemedeki rolü göz önüne alındığında, trikom gen ekspresyonunun incelenmesi ilgi çekicidir. Trikoma özgü genlerin ekspresyonunu karakterize etmek için, önce ilgilenilen trikomlar izole edilmelidir. Trichome izolasyon protokolleri ilk olarak 1992 gibi erken bir tarihte tanımlanmıştır5 ve en son gelişmeleri yakın zamanda gözden geçirilmiştir2. Genel olarak, transkriptomik karakterizasyon için glandüler trikomların ekstraksiyonu için protokoller iki ayrı sıralı adıma ayrılabilir. İlk adım, trikomların bitki dokusundan tamamen fiziksel olarak ayrılmasını içerir. Bu adım, kuru buz5, ticari aparat 6,7 ile cam boncuklar, bitki materyalinin bir ağ elek8’e karşı öğütülmesi veya bitki dokusunun bir izolasyon tamponu9’da vortekslenmesi ile gerçekleştirilebilir. İkinci adım, ilgilenilen trikomların mikroskobik bitki kalıntılarından ve / veya diğer trikom türlerinden daha rafine bir şekilde ayrılmasını içerir. Bu adım, yoğunluk gradyanı santrifüjleme8,10 veyaçeşitli boyutlarda elekler 7,9 kullanılarak gerçekleştirilebilir. İşlenmiş dokulardaki RNA’nın bozunma ajanlarına karşı aşırı duyarlılığı nedeniyle, bu iki ardışık adım genellikle buz gibi soğuk izolasyon ortamında, genellikle protein inhibitörlerinin varlığında gerçekleştirilir4.
Geleneksel trikom izolasyon protokolleri, buz gibi soğuk sıcaklıklara ek olarak, verimli bir ekstraksiyon prosedürü sağlamak için büyük miktarda izolasyon ortamı gerektirir. Bu bileşenlerin birleşimi, yüksek verimi engelleyen zorlu ve zaman alıcı bir yalıtım süreciyle sonuçlanır. Bu nedenle, basit, kullanıcı dostu bir alternatif trikom izolasyon protokolü sunmak, trikom karakterizasyonu ile ilişkili çeşitli yönler için faydalı olacaktır. Bu makale, geleneksel protokollerden çeşitli unsurları birleştirerek ve entegre ederek, saplı ve sapsız glandüler capitate trikomlarını Esrar sativasından izole etmek için alternatif bir protokol sunmayı amaçlamaktadır. Bu elementler arasında kuru buz5, trikomların gözenek boyutları 7,9 azalan birkaç mikro elek içinden geçirilmesi ve izolasyon ortamı8 için sıvı azotun (LN) ikame edilmesi yer almaktadır.
Mevcut trikom izolasyon protokolünün yeniliği, geleneksel protokollerle karşılaştırıldığında, çeşitli şekillerde ortaya çıkmaktadır. Bu protokol, tehlikeli bileşenler gerektirmediğinden kullanışlıdır. Prosedür laboratuvarda minimum önlemle gerçekleştirilebilir ve yüksek verimi kolaylaştırır. Standart sıvı izolasyon ortamının yerine LN’nin ikame edilmesi, izolasyon prosesi boyunca trikomların bütünlüğünü sağlayarak sonraki transkriptomik analizlere olanak tanır. LN ve kuru buzun süblimasyonu üzerine, izole edilmiş trikomlar zararlı artıklardan arındırılmış olarak bırakılır. Ayrıca, LN’nin oda sıcaklığında süblimasyon eğilimi, protokol boyunca cömert kullanımına izin verir. Buna karşılık, büyük miktarlarda geleneksel izolasyon ortamının kullanılması, taşınmasında pratik zorluklar yaratır. Son olarak, protokol disk hücresinin glandüler trikomun kalan kırılgan kafa yapısından ayrılmasını azaltır ve kafa boşluğu içeriğinin tutulmasını sağlar.
Bu protokol, C. sativa glandüler capitate trikomlarının izole edilmesinin teknik uygulamasına yardımcı olmak için tasarlanmış ayrıntılı bir adım adım tarzda sunulmaktadır. Protokol, aşağı akış moleküler analizi için uygun olan yüksek konsantrasyon ve saflığa sahip izole trikomlarla sonuçlanan yönetilebilir bir iş akışı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut trikom izolasyon protokolleriyle karşılaştırıldığında, mevcut protokolde iki ana değişiklik açıklanmaktadır. Bunlar, trikomların ilk adımda kuru buz kullanılarak bitki malzemesinden ayrılmasını ve yaygın olarak kullanılan sıvı tampon ortamının yerine LN’nin kullanılmasını içerir. C. sativa trikom saflaştırması için ilk modifikasyon, trikomları sardunya pedicellerinden ayırmak için ezilmiş kuru buz kullanımını tanıtan daha önceki bir protokole dayanmaktadır<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar CannabiVar Ltd.’den finansal destek aldıklarını kabul etmektedir. Tüm bitki materyali, İsrail’deki Volcani Merkezi’nden Profesör Hinanit Koltai tarafından cömertçe sağlandı.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
